离轴抛物镜扫描中继系统提升双光子显微成像视场

姚 靖，吴 婷，叶世蔚，高玉峰，郑 炜*，秦水介

(1.贵州大学 a.物理学院； b.贵州省光电子技术与应用重点实验室， 贵阳 550025；2.中国科学院深圳先进技术研究院生物医学光学与分子影像研究室， 深圳 518055)

双光子显微镜(two-photon microscopy，TPM)具备快速、高分辨和三维成像能力，被广泛地应用于生物医学[1]、材料科学[2]和电子科学[3]等研究领域。随着脑科学研究的逐渐升温，双光子显微技术得到了进一步的发展。包括组织光透明[4]、自适应光学[5]等技术的开发使得TPM在小鼠脑内的纵向成像深度得到了很大的提高，但横向视场却主要限制在0.5 mm×0.5 mm左右，这种成像视场的局限使得TPM难以开展多脑区的神经活动成像研究。所以，如何实现大视场高分辨TPM成像已经成为了目前光学显微成像领域的研究热点之一[6-9]。

扫描系统设计对于实现大视场高分辨的双光子成像起着至关重要的作用。检流计振镜可以灵活地控制扫描角，从而调节激光扫描区域的大小，这种特性使得它被广泛地应用于TPM的二维扫描系统中。最早使用于TPM的二维扫描系统是由X方向和Y方向的两片检流计振镜紧挨着构成的，中间没有中继光学系统[10,11]。这种设计比较简洁，便于安装调试，但是该方法无法使两片振镜同时共轭到物镜后背孔径处，所以不可避免地会使部分激光能量在扫描过程中损失掉。并且，由于受第一片扫描镜的扫描角度的限制，第二片扫描镜需要增大面积，从而限制了它的扫描速度[12]。在两片检流计振镜中间加入提供中继作用的透镜系统能有效地解决上述问题，并且已经成为常见的TPM扫描系统之一[13-16]。但是，要满足TPM大视场的成像需求，该扫描系统存在一系列技术难点，包括：1)现有的商业透镜由于孔径和焦距的限制，在大角度扫描的情况下，扫描光束很难全部通过共焦透镜中继；2)即使光束全部通过共焦透镜中继，但是随着扫描角度的增大，透镜共焦扫描中继会产生较大的像差[9,17]，对系统的成像质量造成严重的影响，包括成像面的扫描光强沿视场径向方向衰减，成像面不平整等；3)由于TPM需要飞秒激光作为光源，其一般为宽光谱系统。针对宽光谱，透镜系统引入的色差会造成飞秒脉冲展宽，使得双光子激发荧光信号急剧减弱[18]。目前，高端商业TPM会使用专门设计和加工的透镜中继系统，这能极大地改善以上问题，但是，其设计难度和加工成本较高，不适合于探索性为主的实验室研究需求。如何在维持成像质量不变的前提下提升扫描范围同时控制硬件成本仍是当前TPM扫描系统开发待解决的重点问题。

相对于透镜中继系统而言，反射镜中继系统具有天生的无色差优势。美国Amos等[19]在90年代初就提出了利用共焦球面反射镜作为中继系统，并且申请了专利。该系统利用一对球面反射镜共焦放置来实现扫描中继，它很好地解决了中继系统的色差问题，目前已经被广泛地应用于需要更宽光谱的共聚焦显微系统中。早期的双光子显微镜也有用该系统作为中继的，但是由于仅使用一对球面反射镜，无法有效地补偿像差，限制了双光子成像视场，一般视场仅为0.5 mm × 0.5 mm左右[18,20]。Sharafutdinova等[20,21]的研究指出，相对于共焦球面反射镜系统，离轴抛物镜共焦系统能提供更好的扫描线性度和扫描光斑质量，预测该系统可以实现更高成像质量的共聚焦或双光子成像。然而，该研究仍缺乏离轴抛物镜共焦系统像差，如球差(spherical aberration)、扫描过程中边缘视场的像散(astigmatism)、场曲(field curvature)和畸变(distortion)等的量化分析。至今为止，也没有相关研究将离轴抛物镜共焦系统与大视场双光子成像技术结合，来实现高成像质量的视场直径大于3 mm的双光子成像。

在本文中，我们首先借助ZEMAX光学设计软件(Copyright © 2020 ZEMAX LLC. All rights reserved)进行仿真测试，在大扫描角度时，对离轴抛物镜(off-axis parabolic mirror，OAPM)共焦扫描中继系统与传统的双胶合透镜(doublet lens,DB)式共焦扫描中继系统光学性能的优劣进行理论分析对比。包括系统调制传递函数(modulation transfer function，MTF)分析，系统场曲、像散与畸变分析，系统球差分析以及物镜聚焦后光斑点列图与圈入能量的分析。其次，搭建了实际的光学系统，并测量比较了传统的DB与OAPM共焦扫描中继系统像面的聚焦光斑。最后，将OAPM扫描共焦中继加入到自主搭建的双光子显微成像系统中，实现了2.4 mm×2.4 mm(视场直径3.4 mm)的大视场小像差的成像，横向分辨率为1 μm，纵向分辨率为11 μm。利用此显微镜，我们在2.4 mm×2.4 mm的大视场下能够清晰地分辨小鼠大脑切片中微米量级的神经轴突结构。仿真结果和试验结果均表明，OAPM中继系统能有效地解决大视场扫描过程中由扫描系统引起的线性误差和视场边缘像差问题。值得一提的是，本文所涉及的所有光学部件都是现成商业光学元件，无需定制，能极大地缩减双光子系统开发的时间和经济成本。采用本文提出的离轴抛物镜共焦扫描系统能为扫描显微镜技术研发提供较大便利。

1 材料与方法

基于OAPM的共焦扫描中继系统ZEMAX模拟光路图如图1a所示。入射光经X振镜(位于OAPM-1的焦点处)反射后，通过一对离轴抛物镜(MPD229-M01，焦距f=50.8 mm，孔径Φ=50.8 mm，Thorlabs，ZEMAX参数见表1)构成的中继系统，共轭到Y振镜(位于OAPM-2的焦点处)，再由一个F-theta矫正扫描透镜(LSM54-850，焦距f=54 mm，Thorlabs)聚焦。使用多重态的方形反射镜(X方向倾斜机械角为：0°，1°，…，6°)来模拟检流计振镜扫描过程，并进行MTF分析。使用视场角(Y方向视场角参数为：0°，2°，…，12°)来模拟振镜扫描角，并进行像差与光斑属性分析。入瞳位置放置于X-扫描振镜面，入瞳直径设置为5 mm，波长为760 nm。作为对照，传统的DB共焦中继系统ZEMAX模拟光路如图1b所示，将OAPM共焦扫描中继系统的OAPM组更换为双胶合透镜组(89683，焦距f=50 mm,孔径Φ=40 mm，Edmund，ZEMAX参数见表2)，其余组件保持不变。

图1 DB和OAPM扫描中继系统结构示意图Fig.1 DB and OAPM afocal scanning system setup(a)ZEMAX模拟OAPM共焦扫描中继系统图；(b)ZEMAX模拟DB共焦扫描中继系统图；(c)OAPM共焦扫描中继像面光斑测量光路图；(d)DB共焦扫描中继像面光斑测量光路图(a)Optical layout of the OAPM afocal scanning system in ZEMAX;(b)Optical layout of the DB afocal scanning system in ZEMAX;(c)Experimental setup of OAPM afocal scanning system;(d)Experimental setup of DB afocal scanning system

图1c和1d是实际搭建的光学系统示意图。图中激光(Chameleon Ultra II，700～1 000 nm tunable，Coherent)出射后，通过4倍扩束系统(焦距f1=50 mm，f2=200 mm)进行扩束，其后放置一个直径5 mm光阑，之后分别通过OAPM共焦扫描中继系统和传统DB共焦扫描中继系统，再由F-theta矫正扫描透镜进行聚焦，在扫描透镜焦点处使用CCD(E3CMOS，3 072 pixels×2 048 pixels，ToupTek)进行光斑测量分析。

表1 ZEMAX模拟OAPM参数(mm)Tab.1 The parameter of OAPM in ZEMAX simulation (mm)

表2 ZEMAX模拟双胶合透镜参数(mm)Tab.2 The parameter of doublet lens in ZEMAX simulation (mm)

2 结果与分析

2.1 仿真结果与分析

2.1.1 场曲、像散和畸变分析

场曲、像散和畸变是系统像差的重要组成部分。场曲表示为子午(tangential,T)或弧矢(sagittal,S)光束的交点沿光轴方向到高斯像面的距离。像散则描述子午像点和弧矢像点在光轴上分开的距离。对于传统的DB共焦扫描中继系统，如图2a所示，在像面，随着扫描角度的增加，即沿+Y方向，场曲和像散逐渐增大，对比扫描角度为12°与0°(不扫描)时的情况，场曲造成的子午方向(T)轴向移动为-23.13 mm，弧矢方向(S)为-7.82 mm，子午(T)和弧矢(S)像点不重合造成的像散(子午场曲与弧矢场曲之差)为-15.31 mm。这表明了DB共焦扫描中继系统在进行大扫描角度成像时会有极为严重的场曲和像散。该场曲会导致样品面扫描场为大曲率的曲面，将严重影响成像质量。而子午像点和弧矢像点的不重合导致的像散，则导致样品面焦点在某一方向拉长，在成像过程中造成X方向和Y方向的分辨率不等。

对于本文提出的OAPM扫描中继系统中的场曲和像散，如图2b所示，对比扫描角度为12°与0°(不扫描)时的情况，场曲造成的子午方向(T)轴向移动为+0.07 mm，弧矢方向(S)大致为-0.10 mm。子午(T)和弧矢(S)方向像点不重合造成的像散也仅为+0.17 mm左右。这证明了相比于传统的DB系统，OAPM共焦扫描中继系统在场曲与像散方面有了明显的优化。

图2 DB和OAPM扫描中继系统的场曲和畸变曲线对比Fig.2 Comparison of field curvature and distortion profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦扫描中继像面的场曲曲线；(b)OAPM共焦扫描中继像面的场曲曲线；(c)DB共焦扫描中继像面的畸变曲线；(d)OAPM共焦扫描中继像面的畸变曲线 (a)The field curvature profile in the image plane of DB afocal scanning system;(b)The field curvature profile in the image plane of OAPM afocal scanning system;(c)The distortion profile in the image plane of DB afocal scanning system; (d)The distortion profile in the image plane of OAPM afocal scanning system

畸变是垂轴像差，不会影响像的清晰程度，只会改变轴外物点在像面的成像位置。在TPM中，系统的畸变会对扫描过程的线性造成影响，畸变越小，则扫描过程越趋于线性。从图2c和2d中，可以看到两系统的畸变对比，OAPM共焦扫描中继系统的畸变(-1.57%)相比于传统的DB共焦扫描中继系统(-2.75%)也减小了将近1倍。所以，使用OAPM共焦扫描中继作为双光子显微成像系统的扫描中继系统，在扫描线性度方面能得到明显的提升。

2.1.2 球差分析

球差是轴上点像差，即轴上点发出的同心光束经光学系统后，不再是同心光束，不同入射高度的光线经过光学系统后交光轴于不同位置，相对于近轴像点有不同程度的偏离，导致在高斯像面的像点不是一个点，而是一个圆形的弥散斑。球差会使本应该集中在中心位置处的能量弥散。在TPM中能量的弥散会造成分辨率下降以及信噪比降低。传统的DB共焦扫描中继和OAPM共焦扫描中继的轴向球差曲线如图3a和3b所示，OAPM共焦扫描中继系统的球差仅是DB中继系统的1/4左右。

图3 DB和OAPM扫描中继系统的轴向球差对比Fig.3 Comparison of spherical aberration profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦扫描中继像面的轴向球差曲线；b)OAPM共焦扫描中继像面的轴向球差曲线 (a)The longitude spherical aberration profile in the image plane of DB afocal scanning system;(b)The longitude spherical aberration profile in the image plane of OAPM afocal scanning system

2.1.3 调制传递函数MTF对比分析

调制传递函数MTF是成像光学系统像质评价的另一个重要指标。图4为不同扫描角下的MTF曲线，其横坐标表示空间频率，单位为每毫米可分辨的线数。MTF值降为0时的空间频率，称为截止频率，即系统分辨细节的能力。截止频率越大，MTF曲线变化越平稳，空间频率和MTF值围成的面积越大，则系统的成像质量越好。

在传统的DB共焦扫描中继系统(图4a)中，随着振镜扫描角的增大，系统能通过的截止频率出现严重地下降。当扫描角增大到6°往上时，系统所能通过的空间频率成分不足衍射极限的1/12，这时系统的成像性能已无法满足成像的需求。这种情况在实际的扫描系统中会严重地影响到物镜下聚焦光斑的形状，导致这种情况的主要因素是当扫描角增大时，场曲增加，光束不能有效地聚焦在像面上，另外，由于子午弧矢方向焦点位置不同，像散增加，最终影响边缘视场的荧光信号强度和成像分辨率。

然而，在本文提出的OAPM扫描中继系统(图4b)中，随着振镜扫描角度的增加，由于其对各类像差的优化，在各个扫描角的MTF曲线中，截止频率和衍射极限曲线相同，各频率成分的MTF透过率同衍射极限MTF相比只有极小的衰减。这说明在进行大视场扫描时，OAPM共焦扫描中继系统的成像性能和不扫描时(0°)的基本相同，在TPM中使用OAPM共焦扫描中继能显著地提高成像质量。

2.1.4 中继系统像面光斑分析

点列图分析是另一种较为直观的像质整体分析方式，主要通过像面聚焦光斑的形状比较来观察整个成像系统的优劣。通过DB共焦扫描中继系统和OAPM共焦扫描中继系统之后在像面的点列图分别为图5a和5b所示。对于传统的DB共焦扫描中继系统(图5a)，随着扫描角的增大，由于严重的场曲、像散以及球差等的影响，像面光斑的均方根(root-mean-square，RMS)半径从0°视场角(衍射极限艾里光斑半径为9.90 μm)的7 μm弥散至12°视场角时的588 μm。对于本文提出的OAPM共焦扫描中继系统在像面的点列图，即使在大扫描角度12°的时候，光斑的RMS半径为7.09 μm，同衍射极限9.90 μm相近。与像面的光斑点列图相对应，图5c和5d分别为传统的DB共焦扫描中继系统和OAPM共焦扫描中继系统的像面圈入能量图。对于DB共焦扫描中继系统，随着扫描角的增大，聚焦光斑逐渐弥散；而对于OAPM共焦扫描中继系统，即使大角度扫描时，聚焦光斑也基本上集中于艾里光斑内。

2.2 试验结果与分析

2.2.1 中继系统像面光斑形状测量

实际系统很难精确测得各类像差的具体分量，考虑到我们设计中继系统的最终目的是为了实现高分辨大视场成像，具体体现在双光子成像系统上就是要求在样品面上有较好的光学聚焦光斑，所以在实际试验验证系统中，我们通过测量不同扫描角的光斑形状来对比模拟分析结果。我们搭建了如图1c和1d所示的光斑测量系统，由测量系统得到不同扫描角下两个中继系统的光斑分布情况，如图6所示。

图4 DB和OPAM扫描中继系统的MTF曲线对比Fig.4 Comparison of MTF profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦扫描中继的MTF曲线；(b)OAPM共焦扫描中继的MTF曲线 (a)The MTF profile of DB afocal scanning system;(b)The MTF profile of OAPM afocal scanning system

图5 DB和OPAM扫描中继系统的像面点列图和圈入能量图对比Fig.5 Comparison of the spot size and the energy in the image plane between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦中继系统光斑的点列图；(b)OAPM共焦中继系统光斑的点列图；(c) DB共焦中继系统光斑的圈入能量图；(d)OAPM共焦中继系统光斑的圈入能量图 (a)Spot diagram in the image plane of DB afocal scanning system;(b)Spot diagram in the image plane of OAPM afocal scanning system;(c)Enclosed energy in the image plane of DB afocal scanning system;(d)Enclosed energy in the image plane of OAPM afocal scanning system

图6 CCD测得的DB和OAPM扫描中继系统在不同扫描角度的像面焦点光斑图Fig.6 Focus spots with different scanning-angle in the image plane of DB and OAPM afocal scanning system measured by CCD (a)在传统的DB共焦扫描中继系统中；(b)在OAPM共焦扫描中继系统中 (a)In DB afocal scanning system; (b)In OAPM afocal scanning system

从实测结果也可以得出：在传统DB共焦扫描中继系统中，随着扫描角度的增大，在包括场曲和像散以及球差等像差的影响下，聚焦光斑逐渐弥散；而对于OAPM共焦扫描中继系统，随着扫描角度的增加，聚焦光斑大小同不扫描时(0°)相差不大。通过试验结果进行对比分析，进一步验证了通过ZEMAX模拟分析得出的结论，在大角度扫描时，OAPM更适合作为TPM 的共焦扫描中继。

2.2.2 高分辨率大视场双光子成像结果

为了测试实际的OAPM共焦扫描中继系统在双光子显微镜中的光学性能，基于该共焦中继系统，我们自主搭建了一台大视场双光子显微成像系统(物镜：XLPLN10XSVMP, 10× 0.6NA, Olympus；套筒透镜：88596, 孔径Φ=75 mm, 有效焦距EFL=200 mm, Edmund)。其余部分与OAPM共焦扫描中继系统验证光路相同。实际测得的最大视场为2.4 mm×2.4 mm(对应最大扫描角度12°)，远大于常规双光子显微镜约0.5 mm×0.5 mm的视场大小。实测横向分辨率为1 μm，纵向分辨率为11 μm。通过该系统测量了Thy1-eGFP小鼠脑片，得到如图7a所示的大视场图像(激发波长为920 nm，图像大小1 536 pixels×1 536 pixels)，并可以清晰地分辨出神经元轴突(图7b)。试验结果表明，通过OAPM共焦扫描中继的光学矫正，可以在2.4 mm×2.4 mm的视场下清晰地采集到量级为微米的神经元轴突，为神经科学的研究提供了有效的成像技术手段。

图7 使用OAPM扫描中继的双光子大视场成像结果，样品为Thy1-eGFP小鼠脑片Fig.7 Two-photon microscopy imaging of Thy1-eGFP mouse brain tissue, the system was equipped with our OAPM afocal scanning system(a)2.4 mm×2.4 mm全视场图；(b)在(a)图中红色框选区域，视场为0.8 μm×0.8 μm(a)The whole field-of view image, 2.4 mm×2.4 mm;(b)0.8 μm×0.8 μm field-of-view image at red box in(a)

3 讨论

本项研究的主要目的是解决双光子成像大视场扫描过程中由扫描系统引起的线性误差和视场边缘成像质量较差的问题。鉴于此目的，我们提出了一种基于离轴抛物镜的共焦扫描中继系统，可用于矫正TPM进行大视场成像时的边缘视场像差。相比于传统的DB共焦扫描中继系统，OAPM共焦扫描中继系统具备以下优势：1)场曲、像散、畸变和轴向球差大幅减小；2)即使在大扫描角度下，MTF曲线仍然与衍射极限保持一致；3)像面光斑尺寸不随扫描角度增大而增大，能量基本集中于艾里斑内。在实际的生物样品成像试验中，我们将OAPM共焦中继整合到双光子成像系统内，实现了对Thy1-eGFP小鼠脑片2.4 mm×2.4 mm(视场直径3.4 mm)的大视场成像，并可清晰地分辨微米量级的神经轴突结构。

经典的几何光学理论认为抛物面镜的主要作用在于矫正轴上球差，对轴外像差帮助不大。这个观点对于静态光学成像系统而言是成立的，但是对于中继扫描系统而言，需要特殊考虑。中继扫描系统是一个动态的扫描过程，它的光轴随着扫描角度的不同时刻在变化，换言之，中继扫描系统是由多个不同的静态系统组成的，每个静态系统代表一个扫描角度。在这种情况下，抛物面反射镜可以矫正场曲、像散和畸变，从而提升周边视场的成像质量，增大成像视场。

具体而言， 场曲和像散的改善主要得益于巧妙的OAPM构架设计。OAPM中的抛物面反射镜纵向为抛物线面型，横向为球面面型，并且抛物面反射镜的焦点也是球面镜的焦点。入射平行光由位于抛物面反射镜焦点处的X-扫描镜投射到抛物面反射镜上，并沿球面方向做横向扫描。对于球面反射镜而言，圆心处发出的小口径平行光入射球面任何反射区域都是等价的，所以扫描过程中，横向焦距基本不变。另外，由于纵向焦距有抛物面焦距决定并且在扫描过程中也基本不变，致使在扫描过程中，由纵向焦距和横向焦距之差造成的像散得以缓解，从而解决了边缘视场的像散问题。进一步，像散的优化直接造成场曲问题的解决，两者是直接相关的。

而畸变对于扫描中继系统而言，则是由中继系统对扫描角度的线性保持情况来决定的。通俗地讲，如果扫描过程中，中继系统的输出角度和输入角度是线性对应关系，则不会产生畸变，反之则会产生畸变。由于我们的OAPM中继系统是由两片抛物面镜对称放置且严格共焦，由几何光学可知，光束在OAPM-1表面产生的角度偏移(平行光汇聚点相对于理想焦点的偏移)同其在OAPM-2表面产生的角度偏移大小相等且方向相反，该扫描方式造成在OAPM-1扫描产生的弧形畸变和OAPM-2产生的弧形畸变之间相互抵消，从而优化了成像系统的畸变情况。

需要指出的是，虽然该OAPM共焦中继系统在大扫描角度下能对场曲、像散、畸变和球差进行矫正，但是对彗差的矫正效果不明显，这主要是由抛物面反射镜中抛物线的性质决定的。彗差会造成成像分辨率的下降及成像信号的减弱，这也是目前在OAPM共焦中继系统中限制成像视场进一步增大的主要原因之一。在今后的工作中，我们建议可以通过引入透镜组来补偿彗差,从而进一步优化该OAPM扫描中继系统,或通过自适应光学补偿等手段来进一步提高视场边缘的成像质量。

综上所述，本文提出了一种基于离轴抛物镜的共焦扫描中继系统，该系统能有效矫正TPM进行大视场成像时的球差以及扫描引起的像散、场曲、畸变等像差，从而提高视场边缘成像分辨率以及双光子荧光强度。本项研究结果可应用于所有双光子显微成像系统中，有助于推进脑科学研究中多脑区甚至全脑区神经活动的成像研究。