改良钼锑抗比色法测定不同谷子材料组织磷含量

李 萍，李明明，王 浩，晋敏姗，于港华，邢国芳

(山西农业大学农学院， 太谷 030801)

磷(phosphorus，P)是植物生长发育所必须的大量营养元素之一，以多种形式参与植物体内各类生物的化学反应，对作物产量和品质均有至关重要的影响[1]。已有研究表明，土壤中总磷含量为 500～2 000 mg/kg，但由于磷易被土壤吸附、固定形成难溶性化合物或者以有机态的形式存在，使得其在土壤中的移动性小，对作物的生物有效性低，从而不易被植物吸收利用[2-4]，导致出现土壤磷素的“遗传学缺乏”现象[5]。据估计，世界上约有30%的农业土壤处于缺磷状态，缺磷已成为制约作物产量和品质提高的重要非生物胁迫之一[6]。化肥的施用有助于粮食产量的提高，随着世界人口的增加，粮食的需求量也持续上升，化肥的投入量逐年增加。但磷肥施用过量，不仅会对环境造成污染，还会加剧磷矿资源的耗竭。只有准确掌握植物体内的磷状况，才能指导磷肥的合理施用。

提高植物的磷素吸收利用效率一直是世界科学家关注的热点。阮文渊等[7]揭示了水稻响应外界磷素状况调节叶片直立性的细胞学及分子生理学机制，为使用分子设计培育磷高效水稻种质提供了理论依据。易可可团队[8]鉴定了陆生植物液泡无机磷输出的转运体，深化了我们对植物体内磷素平衡机制的认识，同时，在培育磷素高效利用的新品种上有潜在的应用价值。拟南芥中的液泡磷酸转运体1(vacuolar phosphate transporter 1,VPT1)结构域蛋白可将无机磷酸盐转运到液泡中，使植物能够适应土壤中可变的无机磷酸盐的可用性[9]。谷子(Setariaitalica)作为重要的小杂粮作物，具有耐旱、耐盐、耐瘠薄、高光合效率等特性[10]，是中国北方地区最主要的种植作物之一[11]。目前，相关磷效率研究多集中在玉米、水稻、小麦、大豆等大宗作物或模式植物上[12-15]，有关谷子磷营养特性、磷吸收效率及磷含量测定方法的研究鲜见报道。

植物在不同磷水平下的组织器官中磷含量的准确测定对作物的磷素高效利用的研究起着至关重要的作用。目前，常用的磷含量测定方法有钼锑抗比色法和钒钼黄比色法[16]。钼锑抗比色法与钒钼黄比色法相比存在一定的差异。陈玮[17]采用钼锑抗比色法测定了废水中总磷含量，发现该方法具有操作简单、对酸度要求不太严格的特点，适用于一般的化验室分析。李会娟[18]分别采用钼锑抗比色法和钒钼黄比色法检测植物中的磷含量，发现钼锑抗比色法适宜检测磷含量较低的样品，如玉米、小麦等作物的秸秆，而钒钼黄比色法适合测定磷含量较高的样品，如花生籽粒。卢超[19]的研究也证实了这一点，其发现钼锑抗比色法比磷钒钼黄比色法能更加准确地测定湿地植物中的总磷含量。

本试验用改良后的钼锑抗比色法测定了谷子不同材料组织的磷含量，减少了试验步骤，将繁琐的消解步骤简单化，操作方便，提高了磷含量测定的灵敏度，测定结果线性良好，标准差低，精密度很理想，适合植物中低浓度磷的测定，可为不同谷子材料总磷含量测定提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试验仪器

UV-1200 型紫外可见分光光度计(上海美普达仪器有限公司)；LWY84B 型温控式远红外消煮炉(武汉格莱莫检测设备有限公司)；赛多利斯BSA124S电子天平(广州市深华生物技术有限公司)。

1.1.2 试验试剂

浓硫酸(H2SO4，ρ≈1.84 g/cm3，分析纯)。

300 g/L H2O2。

2,4-二硝基酚指示剂溶液：将0.25 g二硝基酚溶解于100 mL蒸馏水中，此指示剂的变色点约为pH 3，酸性时无色，碱性时呈黄色。

4 mol/L氢氧化钠溶液：将16 g NaOH溶解于100 mL蒸馏水中。

2 mol/L硫酸溶液：吸取浓硫酸6 mL，缓缓加入80 mL蒸馏水中，边加边搅动，冷却后加蒸馏水至100 mL。

5.0 g/L酒石酸氧锑钾溶液：取酒石酸氧锑钾[K(SbO)C4H4O6] 0.5 g，溶解于100 mL蒸馏水中。

钼酸铵-硫酸溶液：称取钼酸铵[(NH4)Mo7O24·4H2O] 10 g，溶于450 mL蒸馏水中，缓慢地加入153 mL 浓H2SO4，边加边搅动。

钼锑抗试剂：将上述5.0 g/L酒石酸氧锑钾溶液加入到钼酸铵-硫酸溶液中，最后加蒸馏水至1 L，充分摇匀，贮存于棕色瓶中，此为钼锑混合液。临用前(当天)，称取左旋抗坏血酸(C6H8O5，化学纯)1.5 g，溶于100 mL钼锑混合液中，混匀，此即钼锑抗试剂，有效期为24 h，如藏于冰箱中则可延长有效期。此试剂中的H2SO4浓度为5.5 mol/L(H+)，钼酸铵的质量浓度为10.0 g/L，酒石酸氧锑钾的质量浓度为0.5 g/L，抗坏血酸的质量浓度为15.0 g/L。

磷标准溶液的配制：准确称取在105 ℃烘箱中烘干的KH2PO4(分析纯)0.219 5 g，溶解在400 mL蒸馏水中，加浓H2SO45 mL，转入1 L容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液为50 μg/mL磷标准溶液。吸取磷标准溶液25 mL，稀释至250 mL，即为5 μg/mL磷标准溶液(此溶液不宜久存)。

1.2 试验步骤

1.2.1 样品处理

收集不同的谷子材料，包括谷子新鲜幼嫩叶片、幼嫩根系、成熟叶片、成熟根系、新鲜幼穗、成熟茎秆及液氮冷冻后的相应组织和谷子籽粒。磷处理材料采用本实验室前期筛选出来的谷子磷耐受品种公谷71号和磷敏感品种S1359。材料来源于表1列出，分2个磷浓度梯度(0.005、0.250 mmol/L)进行营养液培养，2周后取材。将取到的所有材料于烘箱105 ℃杀青30 min，再 80 ℃烘干，将样本粉碎后，采用 H2SO4-H2O2消煮，用改良的钼锑抗比色法测定磷含量。

表1 两种谷子材料的来源Tab.1 Sources of two millet materials

1.2.2 样品消解

称粉碎烘干的植物样品约0.3 g，置于100 mL的开氏瓶中，然后加浓H2SO45 mL，轻轻摇匀，瓶口放一个弯颈漏斗，然后逐滴加300 g/L H2O210滴，待消煮炉温度升高至370 ℃，将开氏瓶放到消煮炉上进行消煮，当溶液呈均匀的棕黑色时，从消煮炉上取下开氏瓶，稍冷后，逐滴加300 g/L H2O210滴，并不断摇动开氏瓶，再加热至微沸10 ～20 min，取下稍冷却后，再加入H2O25 ～10滴，摇匀后再消煮，如此重复3 ～5次，直至消煮液呈无色或清亮色后，再加热约5 ～10 min，以除尽过量的H2O2。将开氏瓶取下冷却，用少量蒸馏水冲洗小漏斗洗入瓶中，再将消煮液无损地定容到100 mL容量瓶中，取澄清的上清液供磷元素的测定。消煮时同时做空白试验,空白试验除不加试样外，试剂量和操作方法与测定试样相同，以校正试剂误差。

1.2.3 样品测定

取定容好的5 mL待测液，注入50 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至30 mL，加二硝基酚指示剂2滴，再滴加4 mol/L NaOH溶液直至溶液变为黄色，再加2 mol/L 硫酸溶液1滴，使溶液的黄色刚刚褪去(调节溶液pH为3)，然后加钼锑抗试剂5 mL，再加水定容到50 mL，摇匀，30 min后，选用880 nm波长进行比色。880 nm 的波长，灵敏度较高，空比色皿的吸光度误差几乎为零[9]。以空白试验的吸光度调0为基准，读出测定液的透光率或吸光值。

1.2.4 标准曲线

准确吸取5 μg/mL磷标准溶液0、1、2、4、6、8、10 mL，分别放入50 mL容量瓶中，加水至约30 mL，再加空白试验定容后的消煮液5 mL，调节溶液pH为3，然后加钼锑抗试剂5 mL，最后用蒸馏水定容至50 mL。30 min后进行比色，各瓶比色液磷质量浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL。

1.2.5 结果计算

磷含量可按下式进行计算：

全磷P(%)=ρ·V·ts×10-4/m

式中：ρ—从标准曲线上查得显色液磷的质量浓度(μg/mL)；

V—显色液体积(mL)；

ts—分取倍数：消煮液定容体积(mL)/吸取消煮液体积(mL)；

m—干样品质量(g)。

1.3 数据处理

采用DPS7.05[20]数据处理系统对测定的所有数据进行统计分析，再利用Microsoft Excel 2010软件整理数据并绘制相关图表。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及回归方程

通过磷标准溶液梯度的测定，我们建立了优化的采用钼锑抗比色法测定磷含量的方法，发现在磷标准质量浓度0～1.2 μg/mL之间具有良好的线性关系。改良前的钼锑抗比色法的相关系数为0.953 4，线性方程为y=0.532 9x+0.019 3；而改良后的钼锑抗比色法的相关系数达0.998 1，线性方程为y=1.060 3x-0.010 3，测定结果线性良好。并且分光光度计仪器本身吸光度在0.2 ～0.8为最优区间，线性范围相对较窄，适合植物中低浓度磷的测定，可为不同谷子材料总磷测定提供依据和参考(图1)。

图1 改良前后的钼锑抗比色法测定磷含量标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of phosphorus content by molybdenum-antimony anti-colorimetric method before and after improvement(a)未改良的钼锑抗比色法的标准曲线；(b)改良后的钼锑抗比色法的标准曲线(a)The standard curve of the unmodified molybdenum-antimony anti-colorimetric method;(b)The standard curve of the modified molybdenum-antimony anti-colorimetric method

2.2 改良前后的钼锑抗比色法测定谷子幼嫩叶片和根系的组织磷含量

为了对比改良前后的钼锑抗比色法在测定不同谷子材料组织磷含量时的精密度，我们对同一谷子材料重复3次,计算其平均值、标准偏差及相对标准偏差(relative standard deriation,RSD),以表征该方法的精密度。从表2中可以看出，改良前的钼锑抗比色法测定的谷子新鲜幼嫩叶片的磷含量约为0.210 0 μg/g，新鲜幼嫩根系的磷含量约为0.102 0 μg/g，改良后的钼锑抗比色法测定的谷子新鲜幼嫩叶片的磷含量约为0.243 0 μg/g，新鲜幼嫩根系的磷含量约为0.059 3 μg/g。改良前的钼锑抗比色法在测定谷子叶片及根系组织磷含量时所得的标准偏差比较大，为0.006 6和0.005 2，RSD值也比较大，为3.140 0%和5.090 0%，而改良后的钼锑抗比色法在测定谷子叶片及根系组织磷含量时所得的标准偏差相对较小，为0.003 1和0.000 4，RSD值也比较小，为1.270 0%和0.674 0%。以标准偏差的3倍为磷元素的方法检出限，改良前的钼锑抗比色法计算得的检出限为0.019 8和0.015 6 μg/mL，改良后的钼锑抗比色法计算得出的检出限为0.009 3和0.001 2 μg/mL。通过对比改良前后的钼锑抗比色法测得的谷子叶片及根系的组织磷含量，我们发现改良后的钼锑抗比色法所测得的根系磷含量比改良前少了41.86%，可推测改良前的钼锑抗比色法更适合测定根系的磷含量。改良后的钼锑抗比色法测得磷含量的结果的重复性较好，并且具有良好的精密度。

2.3 改良后钼锑抗比色法测定不同谷子组织材料磷含量

为进一步证实改良后的钼锑抗比色法测定不同谷子材料组织磷含量时的灵敏度，我们对谷子新鲜幼嫩叶片、幼嫩根系、成熟叶片、成熟根系、新鲜幼穗、成熟茎秆及液氮冷冻后的相应组织和谷子籽粒进行磷含量的测定。从表3中可以看出，改良后的钼锑抗比色法测定的谷子新鲜幼嫩叶片的磷含量约为0.243 0 μg/g，新鲜幼嫩根系的磷含量约为0.059 3 μg/g，新鲜成熟叶片的磷含量约为0.137 0 μg/g，新鲜成熟根系的磷含量约为0.171 0 μg/g，新鲜幼穗的磷含量约为0.297 0 μg/g，新鲜成熟茎秆的磷含量约为0.172 0 μg/g；液氮冷冻后的幼嫩叶片的磷含量约为0.287 0 μg/g，液氮冷冻后的幼嫩根系的磷含量约为0.189 0 μg/g，液氮冷冻后的成熟叶片的磷含量约为0.085 7 μg/g，液氮冷冻后的成熟根系的磷含量约为0.207 0 μg/g，液氮冷冻后的幼穗的磷含量约为0.286 0 μg/g，液氮冷冻后的成熟茎秆的磷含量约为0.163 0 μg/g，谷子籽粒的磷含量约为0.013 1 μg/g。该方法在测定不同谷子组织材料磷含量时所得的标准偏差比较小，在0～0.015 8范围之内；RSD的范围在0%～1.81%，以标准偏差的3倍为磷元素的方法检出限，检出限范围在0 ～0.047 4 μg/mL，重复性较好，说明改良后的钼锑抗比色法具有良好的精密度，并且该方法可以用于不同谷子材料磷含量的测定。

表2 改良前后的钼锑抗比色法测定谷子幼嫩叶片及根系磷含量的结果及精密度Tab.2 Results and precision of determination of phosphorus content in young leaves and roots of millet by modified molybdenum-antimony anti-colorimetric method before and after improvement

表3 不同谷子组织材料组织磷含量测定结果及精密度Tab.3 Determination results and precision of phosphorus content in different millettissue materials

表3(续)

2.4 改良后的钼锑抗比色法测定不同磷处理下谷子材料的磷含量

施不同浓度的磷肥可直接影响到植株磷素的含量。缺磷环境下植株各个部位的磷含量都比在正常磷水平下低，种植环境中磷素的缺乏会直接对植株的磷效率产生影响，也直接影响到植株的生长发育[21]。我们采用改良后的钼锑抗比色法分析了磷耐受型和磷敏感型谷子品种(表1所示)在低磷与正常磷水平下地上部叶片的组织磷含量，发现这两个品种在0.005 mmol/L的磷浓度处理下的叶片磷含量低于0.250 mmol/L的磷浓度处理下的叶片磷含量。在0.005 mmol/L的磷浓度下，品种1的叶片磷含量比品种2的叶片磷含量高233.20%，当磷浓度上升到0.250 mmol/L时，两个品种的叶片磷含量分别上升了39.98%和250.94%，品种2的叶片磷含量的上升达到了极显著水平。耐低磷胁迫相对值指数为某一性状低磷胁迫下测定值与正常条件下该性状测定值的比值，相对指数越低，品种越敏感，相对值越高，越耐低磷[22]。我们计算出品种1的耐低磷胁迫相对指数为0.710，品种2的耐低磷胁迫相对指数为0.280。由此可知，品种1为磷耐受品种，品种2为磷敏感品种。

图2 不同磷浓度处理下的谷子磷含量差异Fig.2 Differences in the content of millet phosphorus under different phosphorus concentrations注：柱上** 表示处理间差异达0.05显著水平，柱上*** 表示处理间差异达0.01显著水平Note:** on the column indicates that the difference between treatments reaches the significant level of 0.05, and *** on the column indicates that the difference between treatments reaches the significant level of 0.01

该结果与我们前期筛选所得结果[11]是一致的。所以，改良后的钼锑抗比色法，能有效地检测不同磷浓度处理下植物组织磷含量，利用该方法可以有效地筛选具有磷吸收效率差异的作物品种。

3 讨论

本试验通过改良前后的钼锑抗比色法测定谷子新鲜幼嫩叶片和幼嫩根系的组织磷含量，发现改良后的钼锑抗比色法所测的磷含量在一定范围内有良好的线性关系。用该方法对谷子新鲜幼嫩叶片、幼嫩根系、成熟叶片、成熟根系、新鲜幼穗、成熟茎秆及液氮冷冻后的相应组织和谷子籽粒的磷含量以及不同磷浓度处理下的谷子材料的磷含量进行测定，进一步证实该方法具有良好的灵敏度和精密度。与改良前的钼锑抗比色法相比，二者都选用H2SO4- H2O2对烘干的组织材料进行消煮，不同点是，改良后的钼锑抗比色法在消煮时直接对置于开氏瓶中的材料加5 mL浓H2SO4进行碳化，然后加1 mL H2O2于370 ℃消煮炉上进行消煮。先前的方法是先加蒸馏水润湿样品，再加浓H2SO4进行消煮，由于温度过高，开氏瓶中水沸腾放热，材料容易外喷沾到开氏瓶壁上，不能完全消煮，而造成材料损失，同时给试验人员带来危险，污染了周围环境。用改良后的钼锑抗比色法检测谷子不同组织的磷含量,发现不同谷子组织材料的磷含量存在差异，谷子新鲜幼穗中的磷含量最高达0.297 0 μg/g，成熟籽粒中的磷含量最低为0.013 1 μg/g。改良后的钼锑抗比色法还可以有效地检测不同磷浓度处理下组织磷含量，利用该方法也可以有效地筛选具有磷吸收效率差异的谷子品种。陈玮[17]采用优化的钼锑抗比色法对污水中的总磷含量进行了测定，标准偏差为0.003 4，RSD为5.63%，大大提高了测定磷的灵敏度。本研究中的RSD范围为0%～1.81%，精确度更高。钼锑抗比色法还广泛用于土壤、蔬菜及食品等材料的总磷含量的测定[23,24]。可见钼锑抗比色法是目前测定不同材料磷含量最常见的方法，试验人员为探索最佳测定条件也在对该方法进行不断的优化。

随着世界人口的增加，人们对粮食的需求也逐渐上升，然而在农作物生产过程中，为提高粮食产量，普遍存在磷肥过量施用的现象。解决这些问题关键是提高农业生产中磷的利用效率，减少农业生产给环境带来的不利影响，在保证磷资源可持续利用的前提下提高世界范围内的粮食产量。因此，如何及时有效地监测植物体内的磷状况对指导磷肥的合理施用至关重要。所以本试验对钼锑抗比色法进行了改良，提高了磷含量测定的灵敏度，该方法适合植物中低浓度磷的测定，可为不同谷子材料总磷含量测定提供依据和参考。

随着检测技术的进步，X射线荧光光谱分析法、31P-NMR核磁共振测定植物体内磷含量、基于无机磷荧光指示蛋白测定植物体内磷含量及应用叶绿素荧光技术测定植物中磷缺乏状况等方法不断用于同植物材料组织磷含量的测定当中[16]。国内对于植物组织磷含量的测定方法还没有统一的标准，应建立相应规范的测定标准，以提高植物组织磷含量测定的精确性和可靠性。未来，更精确、更稳定、更灵敏简便易行高效的植物组织磷含量测定方法需要与最新的智能技术结合。只有快速、高效、准确地掌握体内的磷状况，才能减少对环境的污染、减缓磷肥的过量施用现象，才能促进农业生产的发展。