脂蛋白（a）基因单核苷酸多态性变异与冠心病严重程度的关系△

李志根 ，刘 丰，陈竹君，杨峻青，罗德谋，孙 硕，周颖玲

［1.华南理工大学附属第二医院老年心内科广州市第一人民医院，广州 510180；2.广东省心血管病研究所心内科广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510080］

脂蛋白（a）［lipoprotein（a），Lp（a）］是非高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）的一员，其结构与低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）相似。Lp（a）富含胆固醇，颗粒小，具有强致动脉粥样硬化作用。研究表明，Lp（a）浓度主要由位于染色体6q27上编码载脂蛋白（a）的基因（LPA）决定［1］。我们前期的研究表明，LPA 单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）rs6415084变异与中国汉族人群冠状动脉（冠脉）粥样硬化性心脏病（冠心病）患者的Lp（a）浓度呈明显相关［2］，但这种基因变异是否与冠心病严重程度相关目前尚不清楚。本研究将进一步研究LPA SNP 变异与冠心病严重程度的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料

研究对象顺序入选2009年5月至2010年8月于广东省人民医院心内科住院治疗的冠心病患者共517例。入选标准：（1）汉族人群，性别不限，年龄大于18岁，小于80岁；（2）经冠脉造影确诊为冠心病，存在一支或以上冠脉主干或主要分支狭窄程度超过50%。排除标准：（1）合并严重感染、甲状腺疾病、免疫系统疾病或其他可能影响Lp（a）浓度的疾病；（2）正在服用或既往半年内连续服用烟酸、甲状腺素、雄激素、雌二醇及其替代物等可能影响Lp（a）浓度的药物；（3）近3个月内连续服用他汀类药物超过2周。所有患者均自愿参加研究并签署知情同意书。广东省人民医院伦理委员会同意该研究进行。

1.2 方 法

1.2.1 冠脉造影和冠脉严重程度评估 所有患者入院1～3 d 内均完成冠脉造影，每支血管均进行≥3 个体位投照，由两位经验丰富的冠脉介入医师独立采用直径法对血管的狭窄程度进行判定，结果不一致时取两者的平均值作为最终结果。根据4 支血管（左主干、左前降支、左回旋支、右冠脉）中病变血管的不同节段及狭窄程度制定不同的权重系数，最后相加得到Gensini 评分。

1.2.2 LPA 单核苷酸多态性基因检测 采用Taq-Man 法对rs6415084、rs3798220 进行基因分型。利用核酸外切酶对5’特异等位基因染色标记的切除产生持续的检验信号，反应体系：以基因组DNA或聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物为模板；一对PCR 引物，以及分别用FAM 和VIC 标记的2 条MGB 探针检测SNP 的两种类型。在PCR 反应终点读取分型数据。将6-FAM 探针设定为单体型1（野生型），VIC 探针设定为单体型2（变异型）。如检测结果只检测到单体型1，则基因型为野生纯合子；如检测结果只检测到单体型2，则基因型为变异纯合子；如同时检测到单体型1 和单体型2，则基因型为野生/变异杂合子。

1.2.3 一般临床资料及各项指标的测定 检测前记录所有患者的临床基线资料，包括性别、年龄、是否原发性高血压（高血压）、糖尿病、吸烟等情况，并测量身高、体质量、腹围，计算患者的体质量指数（BMI）。抽取10～12 h 空腹静脉血以测定血糖及血脂和肾功能指标，包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL胆固醇、HDL胆固醇、Lp（a）、空腹血糖（GLU）、糖化血红蛋白（HAc1）、肌酐（CREA）和高敏C-反应蛋白（hs-CRP）。

1.3 统计学分析

计数资料采用［n（%）］表示；符合正态分布的计量资料用（）表示，不符合正态分布的连续变量采用［M（P25～P75）］表示。两组间符合正态分布的连续性变量比较采用t检验，不符合正态分布的连续性变量比较采用Mann-whitneyU非参数检验。如最小基因型频率＜5%，将其与中间基因型合并后再进行统计。以P＜0.05 为有统计学意义，采用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理。

2 结果

2.1 患者的基线特征

本研究共入选冠心病患者517例，其中男性占82.4%，年龄（63.4±11.5）岁，其中23.6%的患者合并糖尿病，58.6%的患者合并高血压，37.5%的患者有吸烟史（见表1）。其中入院诊断为稳定型心绞痛（SA）的患者129例（25.0%），不稳定型心绞痛（UA）患者33例（37.3%），急性心肌梗死（AMI）患者195例（37.7%）。冠脉造影示24.8%的患者为单支病变，31.3%的患者为两支病变，43.9%的患者为三支病变（见表2）。

2.2 患者LPA 单核苷酸多态性基因型分布和单体频率比较

患者的基因型分布和单体频率见表3。Rs64-15084 和rs3798220 变异在中国汉族冠心病患者中较常见，其变异单体频率分别为10.1%（单体T）和8.1%（单体G）。将患者按Lp（a）浓度分为Lp（a）正常组［Lp（a）＜30 mg/dL］和Lp（a）浓度升高组［Lp（a）≥30 mg/dL］。与Lp（a）浓度正常组患者相比，Lp（a）浓度升高组患者的rs6415084 的变异单体频率（单体T）显著升高（P＜0.001），但两组患者的rs3798220变异单体频率没有显著异差（P=0.174）。

表1 患者一般基线资料 ［±s，n（%）］

表1 患者一般基线资料 ［±s，n（%）］

表2 入选患者冠心病类型和病变支数 ［±s，n（%）］

表2 入选患者冠心病类型和病变支数 ［±s，n（%）］

表3 患者LPA SNP 基因型分布和单体频率比较 ［n（%）］

2.3 各单核苷酸多态性基因型患者血脂浓度比较

患者各SNP 按野生型基因和变异型基因分组，并比较各SNP 两组患者之间的血脂浓度。结果表明，与含有rs6415084 野生型基因（CC）的患者相比较，存在基因变异的基因（CT/TT）患者的Lp（a）浓度明显升高（P＜0.001），但两组患者的TC、TG、LDL 胆固醇和HDL 胆固醇浓度并没有明显差异（P均＞0.05）；然而，rs3798220 的两个基因型分组之间的Lp（a）和其他血脂成份浓度均没有显著差异（P均＞0.05），见表4。

2.4 各单核苷酸多态性基因型患者冠状动脉病变严重程度比较

将患者各SNP 按野生型基因和变异型基因分组，并比较各SNP 两组患者之间的冠脉病变支数和Gensini 评分。结果表明，尽管rs6415084 两个基因型患者的血管病变构成比没有显著差异，但以Gensini 评分对患者的冠脉病变严重程度进行量化后，与携带野生型基因的患者相比较，携带变异单体患者的冠脉Gensini 评分显著升高（P=0.025）；然而，rs3798220 的两个基因型分组之间的无论是血管病变支数还是患者冠脉的Gensini 评分均没有显著差异（P均＞0.05），见表5。

表4 冠心病患者各LPA SNPs 基因型血脂浓度比较 ［±s，M（P25～P75）］

表4 冠心病患者各LPA SNPs 基因型血脂浓度比较 ［±s，M（P25～P75）］

表5 冠心病患者各LPA SNPs 基因型冠脉病变支数和Gensini 评分比较 ［±s，n（%）］

表5 冠心病患者各LPA SNPs 基因型冠脉病变支数和Gensini 评分比较 ［±s，n（%）］

3 讨论

血浆Lp（a）浓度受年龄、性别和环境因素的影响较小，主要由位于染色体6q27 上编码载脂蛋白（a）的基因（LPA）决定［1］。近年来使用基因芯片技术可以高通量快速扫描与某个疾病相关的SNP。Clarke 等［3］用基因芯片对冠心病患者及正常对照者2 100 个候选基因上48 742 个SNP 进行了分析，发现位于6q26-27 区域编码载脂蛋白（a）的基因变异（rs10455872 和rs3798220）与冠心病风险关联最强，并且这两个位点变异与高加索人血浆Lp（a）浓度和LPA K4-2 重复数目明显相关。Rs3798220变异可解释8%的Lp（a）浓度的变异，rs10455872变异可解释25%的Lp（a）浓度的变异，联合分析表明，这2 个SNP 位点变异对血浆Lp（a）浓度的影响的权重可占到36%。然而，LPA 变异在各个人群中存在差异，主要表现为同一位点变异在某个人群中较常见，在另一个人群中少见或根本不存在变异；我们之前的研究表明，rs10455872 变异在汉族冠心病患者罕见［2］。尽管rs3798220 变异在汉族冠心病患者较常见，其变异频率甚至比高家索人群更高（8.1%vs.1.4%），但本研究结果表明其变异与本研究患者的血浆Lp（a）浓度并未见明显的相关，因此，也没有发现其变异与患者冠脉严重程度的相关性。其原因未明，变异单体频率差异和LPA K4-2 重复数目变异相关的载脂蛋白（a）形状的异质性有可能部分解释同一基因变异对两个人群Lp（a）浓度不同的影响［4-5］。

研究表明，编码载脂蛋白（a）的基因和编码纤溶酶原的基因结构相似，它们都含有链内二硫键稳定的环状结构［被称为kringle 结构域，K 结构域］。纤溶酶原基因含有5种编码不同K 结构域的编码系列（K1～K5），其中的两种编码系列也出现在载脂蛋白（a）基因，它们分别编码K4 和K5 结构域。载脂蛋白（a）基因共有10 种不同的K4 编码系列，包括K4-1 型至K4-10 型，其中K4-1 型和K4-3 至K4-10 型呈单倍拷贝，而K4-2 型呈多倍拷贝，拷贝数从3 倍至大于40 倍不等，其相应的表达产物载脂蛋白（a）呈现大小不同的亚型，包含12～50 个K4 结构域，分子量300～800 kDa 不等，具有很大的异质性［4，6］。一般来说，载脂蛋白（a）基因含有的K4-2 型编码系列重复越少，其编码的载脂蛋白（a）蛋白的分子量越小，则血清Lp（a）浓度越高［7-9］，其致动脉粥样硬化的能力可能更强［10］，并且这种含有小载脂蛋白（a）的Lp（a）对他汀类药物治疗无反应甚至进一步升高［11］。因此，我们推测，尽管中国汉族冠心病患者rs3798220 也出现了变异，但其变异基因含有的K4-2 型编码系列重复可能与高加索人存在差异，更大的可能是汉族冠心病患者rs3798220 变异基因含有的K4-2 型编码系列重复更多，因此表达出的Lp（a）浓度并没有升高，但其具体机制须实验室研究进一步证实。

本研究表明，rs6415084 变异在中国汉族冠心病患者中比较常见，其变异单体频率为10.1%，其结果与SHARE 队列中国人群的研究结果相一致。本研究发现，rs6415084 变异与中国汉族冠心者患者的Lp（a）浓度明显相关，与携带野生型基因的患者相比较，携带变异基因患者的Lp（a）浓度明显升高（P＜0.05）。进一步的分析表明，携带变异基因患者的冠脉病变更严重，表现为Gensini 评分更高（P=0.025）。本研究提示，rs6415084 变异首先引起患者的Lp（a）浓度升高，而升高的Lp（a）浓度具有明显的致动脉粥样硬化作用，研究表明，Lp（a）浓度升高是冠心病的独立危险因素并且是冠心病的不良预好的独立预测因子［12-14］。

升高的Lp（a）浓度有可能通过以下几个机制促进动脉粥样硬化的发生、发展：（1）Lp（a）可以在动脉粥样斑块聚集、与载脂蛋白B 结合并且被泡沫细胞摄取［15-16］；（2）载脂蛋白（a）通过促进内皮细胞黏附因子产生、泡沫细胞形成、平滑肌细胞迁移等作用，在动脉粥样硬化发展过程中起重要作用［17］。Lp（a）的致动脉粥样硬化作用不仅与它的浓度相关，并且与载脂蛋白（a）独特的结构和形状相关，后者具有明显的多态性。这就决定了不同人群除了Lp（a）浓度不同外，它的致动脉粥样硬化能力也可能存在差异。例如，虽然黑人的Lp（a）浓度较其他人群明显升高，但并没有发现Lp（a）浓度升高是黑人冠心病的危险因素［18-20］，其原因可能与黑人Lp（a）的载脂蛋白（a）结构与高加索人不一样有关，这点在临床研究中得到证实。Paultre 等［10］检测了576例经冠脉造影证明的冠心病患者（包括白种人和非裔美国人）的Lp（a）浓度和载脂蛋白（a）亚型，研究Lp（a）浓度、载脂蛋白（a）亚型和两者结合分别与冠心病风险的关系。结果表明，Lp（a）浓度升高见于26%白种人和68%非裔美国人。在Lp（a）浓度升高的人群中，80%的白种人含有小分子载脂蛋白（a）亚型，但只有26%的非裔美国人含有小分子载脂蛋白（a）亚型。在所有患者中，只在含有小分子载脂蛋白（a）的白人男性和黑人男性中观察到Lp（a）浓度升高与冠心病风险明显相关（P＜0.01），并且这种相关在校正了年龄、吸烟、糖尿病、高血压以及HDL 胆固醇、LDL 胆固醇和三酰甘油浓度后仍然显著，提示含有小载脂蛋白（a）亚型的Lp（a）的致动脉粥样硬化作用更强；但这种现象在女性人群中并不显著［21-22］，提示Lp（a）作为冠心病的危险因素存在种族和性别差异。因此，从基因水平和相应的分子水平研究有助于阐明Lp（a）在不同人群的致动脉粥样硬化作用。

本研究的结果表明，rs6415084 变异首先引起个体的血清Lp（a）浓度升高，并且这些个体的Lp（a）可能是含有小载脂蛋白（a）亚型的Lp（a），因此具有更强的致动脉粥样硬化作用，导致患者的冠脉病变程度更重，但其具体机制须进一步研究证实。本研究具有一定的局限性：本研究未纳入正常人群作为对照组，不清楚冠心病和健康人群之间相关SNP 基因频率是否存在差异，因此未能计算rs6415084 单体变异的相关冠心病风险。

总之，本研究结果表明，LPA SNP rs6415084 和rs3798220 位点变异在中国汉族人群冠心病患者中较常见。在研究的SNPs 中，只有rs6415084 变异与患者的Lp（a）浓度相关，并且进一步的研究表明，rs6415084 变异可能与冠心病患者的冠脉严重程度相关。