HPLC法测定不同产地和品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量

涂勋良 张利 秦帆 万斌 吕秀兰

摘 要：  該研究建立了同时测定檬苦素和诺米林含量的高效液相色谱法，并采用该方法对8种不同柠檬样品中柠檬苦素和诺米林含量进行了测定。色谱条件如下：安捷伦Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）色谱柱，流动相为0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，柱温为

30 ℃，波长为210 nm。结果表明：3个产地尤力克果皮中柠檬苦素含量依次为云南瑞丽（EUR_D）、四川安岳（EUR_C）和广东河源（EUR_Y），诺米林含量依次为EUR_D、EUR_C和EUR_Y;不同品种柠檬果皮中柠檬苦素含量依次为北京柠檬（M_NM）、粗柠檬（R_NM）、无核柠檬（S_NM）、热那亚（RNY）、里斯本（LSB），诺米林含量依次为S_NM、R_NM、LSB、RNY和M_NM。综上结果表明，不同产地和品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量均存在不同程度差异，该HPLC法可为不同产地和不同品种柠檬果实质量鉴别、资源评价及深度开发提供理论依据。

关键词： 柠檬， 柠檬苦素， 诺米林， 高效液相色谱法（HPLC）

中图分类号：  Q946

文献标识码：  A

文章编号：  1000-3142（2020）05-0744-07

Determination of limomin and nomilin of different varieties of lemon peel from different areas by HPLC

TU Xunliang1， ZHANG Li3， QIN Fan1， WAN Bin1， L Xiulan2*

（ 1. Horticulture Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China; 2. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China; 3. College of Sciences， Sichuan Agricultural University， Yaan 625014， Sichuan， China ）

Abstract：  This study established an high-performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of limonin and nomilin in Citrus limon， and the contents of limonin and nomilin in eight different lemon samples was determined by this method. The chromatographic condition was performed on an Agilent Eclipse XDB-C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） column. The mobile phase consisted of 0.1% aqueous phosphoric acid （A） and acetonitrile （B） was invoked as gradient elution with the flow rate at 1.0 mL·min-1. The column temperature was set at 30 ℃ and the detection wavelength was set at 210 nm. The results were as follows： The content of limonin in the lemon peel of three producing areas was Ruili， Yunnan （EUR_D）， Anyue， Sichuan （EUR_C） and Heyuan， Guangdong （EUR_Y） respectively， while the content of nomilin was EUR_D， EUR_C and EUR_Y; The content of limonin in different varieties of lemon peel was Meyer lemon （M_NM）， Rough lemon （R_NM）， Seedless lemon （S_NM）， Genoa （RNY） and Lisbon （LSB）， while the content of nomilin were S_NM， R_NM， LSB， RNY and M_NM. The results displayed that the content of limonin and nomilin in lemon peel from different areas and varieties was different. The HPLC method can provide a theoretical basis for the quality identification， resource evaluation and in-depth development of lemon fruits from different areas and varieties.

Key words： Citrus limon， limomin， nomilin， high-performance liquid chromatography （HPLC）

柠檬苦素类似物（limonoids）是存在于芸香科（Rutaceae）和楝科（Meliaceae）植物中的一类具有呋喃环并且高度氧化的三萜类次生代谢产物（Maier et al.， 1977）。在柑橘属中主要有苷元和糖苷两大类（潘利华等， 2007），它们是引起柑橘属果汁泛苦的主要原因之一。迄今已从柑橘属中分离出38种类似物和21种配糖体（Manners， 2007），常见的有柠檬苦素（limomin）、诺米林（nomilin）、奥巴叩酮（obacunone）、诺米林酸（nomilinic acid）和脱乙酰诺米林（deacetylnomilin）等。诺米林在植物茎韧皮部合成并转移至其他组织（Moriguchi et al.， 2003），在酶的作用下，通过不同生物合成途径合成柠檬苦素、醋酸柠檬苦酯、宜昌根辛和卡拉敏等类似物（蔡护华和桥永文男， 1996）。柠檬苦素类似物具有抗癌（Tanaka et al.， 2000;Miller et al.， 2004）、抗氧化（Sun et al.， 2005;Zou et al.， 2016）、抑菌（罗水忠等， 2006;李彪等， 2012b）、抗炎镇痛（温靖等， 2007）、除虫杀虫（李彪等， 2012a）、抑制HIV病毒复制（Battinelli et al.， 2003;Yu et al.， 2015）、降低胆固醇等多种生物活性。

目前，柠檬苦素类似物主要测定方法有分光光度法（田庆国和丁霄霖， 1999）、放射免疫测定法（Mcintosh， 2000）、薄层色谱法（Ohta et al.， 1993）、毛细管胶束电色谱方法（Raynor et al.， 2015）、快速色谱法（flash chromatography）（Raman et al.， 2005）、高效液相色谱法（Bilal et al.， 2013;Breksa et al.， 2015;Manners et al.， 2015）、LC/MS（Manners et al.， 2004;Woo et al.， 2006）、LC-ToF/MS（Yu et al.， 1993）。Bilal et al.（2013）采用HPLC法测得血橙中柠檬苦素为479.77 μg·mL-1，粗柠檬中诺米林为54.23 μg·mL-1，甜橙‘succari中诺米林仅为0.37 μg·mL-1。孟鹏和郑宝东（2012）采用UPLC法测得柠檬苦素含量依次为琯溪蜜柚>脐橙>尤溪金柑>柑橘，诺米林含量依次为脐橙>琯溪蜜柚>柑橘>尤溪金柑。彭腾等（2012）采用RP-HPLC法测得柠檬苦素含量依次为沙糖桔（金堂）>蜜橘（广元）>蜜橘（龙泉）>椪柑（新津）>椪柑（金堂）>广柑（青白江）>蜜橘（蒲江）。

为了提高柠檬副产物的高效利用率，促进柠檬产业蓬勃发展，本研究选取了3个不同产地和5个不同品种柠檬为供试材料，采用HPLC法对柠檬苦素和诺米林含量进行定性和定量分析，发现不同柠檬果品间的含量差异，为柠檬品种鉴定、资源开发利用提供理论依据，从而提高柠檬果品的综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试劑

样品为相同成熟度的成熟柠檬果实，柠檬样品信息详见表1。将果肉与果皮分离，果皮样品经冷冻干燥→粉碎后备用。

BT124S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）;FW-80高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）; LC-20AB型高效液相色谱仪 （日本Shimadzu公司）;LGJ-12冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）;SB-600DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;UPH-Ⅱ-20T超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）;索氏提取器。

对照品柠檬苦素（批号MUST-13021606）、诺米林（批号MUST-12072101）购自成都曼思特生物科技有限公司，化学结构式如图1所示，各标准品纯度均满足定量检测需求;乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）;磷酸、丙酮和石油醚（60～90 ℃）（均为分析纯）购自成都科龙化工试剂厂;自制超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm × 4.6 mm， 5 μm）;流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脱：10%～50% B（0～10 min），50%～60% B（10～20 min），60%～90% B（20～25 min），90%～10% B（25～35 min，10% B（35～40 min）;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：210 nm;柱温：30 ℃;进样体积：10 μL。

1.2.2 对照品溶液制备 精确称量对照品柠檬苦素2.83 mg、诺米林2.54 mg，分别用80%丙酮溶解到10 mL容量瓶中，超声使其充分溶解，定容，配成283 mg·L-1柠檬苦素和254 mg·L-1对照品储备液。吸取适量对照品储备液采用梯度稀释法配制了系列质量浓度的混合标准溶液。

1.2.3 供试品溶液制备 用定量滤纸包好冷冻干燥后的果皮样品，用石油醚（60～90 ℃）在索氏提取器内彻底脱脂24 h，将脱脂样品置于干燥器中，待石油醚（60～90 ℃）完全挥发，样品干燥后取出备用。称取0.5 g上述粉末，置具塞锥形瓶中，加入80%丙酮溶液10 mL，称重，超声（80 W，40 kHz，50 ℃）1.5 h，冷却后用80%丙酮补重。0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液备用。

2 结果与分析

2.1 HPLC色谱结果

混合对照品与EUR_C供试品溶液的HPLC色谱图详见图2。在1.2.1条件下，柠檬苦素和诺米林分离度均大于1.8，分离效果极佳，目标峰对称性好。

2.2 标准曲线的建立

在1.2.1条件下，平行测定各质量浓度按1.2.2制备的混合对照品溶液3次，取其峰面积平均值，以对照品质量浓度为X坐标，平均峰面积为Y坐标，绘制标准曲线。结果显示柠檬苦素和诺米林在一定质量浓度范围内与相应峰面积之间线性关系良好（表2）。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 在1.2.1条件下，重复测定6次按1.2.2制备的混合对照品储备液，结果显示柠檬苦素和诺米林平均峰面积的RSD分别为0.88%、0.95%，说明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 在1.2.1条件下，取按1.2.2制备的EUR_C供试溶液，分别于0、2、4、6、8、12和24 h后进行HPLC分析，结果显示柠檬苦素和诺米林平均峰面积的RSD分别为0.76%、1.02%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 重现性试验 在1.2.1条件下，重复测定6次按1.2.2制备的EUR_C供试溶液，结果显示柠檬苦素和诺米林平均峰面积的RSD分别为0.63%、0.78%，说明该方法重现性较好。

2.3.4 加标回收率试验 在1.2.1条件下，在EUR_C供试溶液中加入定量的对照品储备液，重复测定6次，由表3可以看出，柠檬苦素和诺米林的加标回收率分别为100.36%、99.79%;RSD分别为1.07%、1.12%，说明该方法准确度较高。

2.4 不同产地柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量测定结果

在1.2.1条件下，参照1.2.2制备供试品溶液，对不同产地尤力克柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林进行定量和差异性分析，结果见表4。

由表4可知，不同产地尤力克果皮中柠檬苦素和诺米林含量存在不同程度的差异。云南瑞丽和四川安岳两地的尤力克柠檬果皮中柠檬苦素的含量没有差异，含量分别为0.421和0.418 mg·g-1，广东河源的尤力克柠檬果皮中柠檬苦素的含量为0.337 mg·g-1，与云南瑞丽和四川安岳两地的含量呈显著差异;不同产地对尤力克柠檬果皮中诺米林含量的影响较大，其中云南瑞丽的含量最高，为0.269 mg·g-1，其余两地依次是四川安岳（0.219 mg·g-1）和广东河源（0.070 mg·g-1），云南瑞丽与四川安岳两地的含量呈显著差异，且均与广东河源产地的含量呈极顯著差异。

2.5 不同品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量测定结果

在1.2.1条件下，参照1.2.2制备样品溶液，对不同品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林进行定量和差异性分析，结果见表5。

由表5可知，不同品种柠檬果皮中柠檬苦素和诺米林含量差异显著。北京柠檬中柠檬苦素的含量与其他4个品种存在极显著差异，达到0.589 mg·g-1，其余依次为粗柠檬（0.464 mg·g-1）、无核柠檬（0.393 mg·g-1）、热那亚（0.334 mg·g-1）、里斯本（0.326 mg·g-1），且粗柠檬与无核柠檬、热那亚、里斯本也存在极显著差异，而后三者之间无差异。里斯本、热那亚和北京柠檬的诺米林含量存在显著差异，含量分别为0.203、0.130、0.050 mg·g-1，而无核柠檬和粗柠檬与前三者含量之间的差异极显著，且两者之间差异极显著，含量分别为0.688、0.386 mg·g-1。

3 讨论与结论

高效液相色谱法（HPLC）是测定柠檬苦素类似物最常用的方法之一。Manners et al.（2015）建立了同时测定不同柑橘种子中17种柠檬苦素类似物含量的高效液相色谱法;刘亮等（2007）建立了同时测定柑橘中柠檬苦素和诺米林含量的高效液相色谱法。本研究建立了同时测定不同柠檬果品中柠檬苦素和诺米林含量的高效液相色谱法，采用常规的乙腈-磷酸缓冲体系可在20 min内完成柠檬苦素和诺米林的同时测定。该方法操作简单，具有较好的精密度、重现性、稳定性及高回收率等特点，可作为测定柠檬果品中柠檬苦素和诺米林含量的常规分析方法，为柠檬果实质量评价提供理论依据和手段。

柠檬苦素类似物研究主要集中在不同类型柑橘比较，少有不同产地与不同品种间的比较。本研究对供试样品中柠檬苦素和诺米林的检测结果表明成熟柠檬果品中柠檬苦素含量明显高于诺米林含量，无核柠檬（柠檬苦素：0.393 mg·g-1，诺米林：0.688 mg·g-1）除外。这是因为诺米林是柠檬苦素类似物生物合成途径的原始前体，柠檬苦素生物合成途径是柑橘类水果中柠檬苦素类似物的主要代谢途径（蔡护华和桥永文男，1996），诺米林含量的降低意味着柠檬苦素含量的升高，形成“此消彼长”的趋势，该研究结果与此相同。

从本研究结果可以看出，3个产地的尤力克果品中柠檬苦素和诺米林含量存在显著差异，这与3个产地的气候条件、水分和土壤等条件息息相关。柠檬树体生长和果实发育的适宜年均气温为17～19 ℃，四川安岳的年均气温为18.5 ℃，年均降水量为924.9 mm，正是柠檬生长的最佳适宜条件，安岳年产柠檬鲜果70万t，占全国总产量的80%，排全世界第8位，综合上述因素，安岳被称为“中国柠檬之乡”。从5个不同品种柠檬的比较实验结果可得出柠檬苦素含量依次为北京柠檬>粗柠檬>无核柠檬>热那亚>里斯本，诺米林含量依次为无核柠檬>粗柠檬>里斯本>热那亚>北京柠檬。8个柠檬果品中柠檬苦素和诺米林的含量差异显著，其累积规律与不同产地的生态气候条件、不同品种、不同部位、不同生长发育阶段、不同采收期及采后储运等诸多因素密不可分。随着柠檬多元化的功能性产品开发，有待进一步对柠檬种植资源进行综合的品质评价，建立完善的质量评价体系。依据不同品种活性成分含量的差异，培育并栽培推广专用型的柠檬品种，具有广泛的市场前景。

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（责任编辑 周翠鸣）