一株肉鸡源大肠杆菌的分离鉴定与致病性分析

丁树荣

摘  要：为了解规模化肉鸡养殖场致病性大肠杆菌的耐药性与致病性，并为规模化养殖场提供大肠杆菌病的防治参考。从山西省某规模化肉鸡养殖场采集病死鸡病料，进行大肠杆菌的分离培养、生化鉴定、药敏试验、致病性试验。结果表明：分离到1株血清型为O2的致病性大肠杆菌，分离菌对头孢类、喹诺酮类等8种药物耐药，对妥布霉素、阿米卡星高敏，对强力霉素、氧氟沙星中敏。结论：分离株肉鸡源大肠杆菌具有多重耐药性和较强的致病性，季节交替要加强鸡场饲养管理。

关键词：肉鸡;大肠杆菌;分离鉴定;药敏试验;致病性分析

中图分类号：S858.314.4+3    文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2020）5-0045-04

2019年5月山西省晋中市某肉鸡养殖场饲养的30000只33日龄科宝肉鸡出现鸡只死亡增多的现象，病死鸡剖检可见气囊浑浊，心包积液，腹腔内有纤维素样渗出物，肠粘膜充血，偶见出血，盲肠扁桃体出血。初步诊断为大肠杆菌感染，无菌采取病死鸡的肝组织、肺组织样品，冰盒保存，送实验室12h内进行细菌的分离培养鉴定。

1  材料与方法

1.1  材料  检测样品，为某肉鸡养殖场送检的病死鸡;试验用培养基，购自青岛宾得生物技术有限公司，实验室现配现用;细菌微量生化反应管和药敏试纸，购自杭州滨和微生物试剂有限公司;PCR试剂，购自北京美吉桑格生物医药科技有限公司;大肠杆菌“O”抗原单价血清，中国兽医药品监察所生产。试验动物，1日龄商品代雏鸡20只，山西省太原市北格种鸡场馈赠。

1.2  细菌分离培养  称取0.1g的病死鸡肺组织样品，生理盐水梯度稀释，接种于麦康凯培养基，温箱37℃培养过夜。挑选粉红色单菌落，再次接种于伊红美蓝琼脂，37℃过夜培养。挑选有金属光泽的菌落接种于肉汤，振荡培养后温箱过夜，染色镜检。

1.3  生化鉴定  按照《伯杰氏细菌鉴定手册》[1]，将肉汤培养基中的菌液，分别滴入生化反应管鉴定。

1.4  PCR鉴定  根据大肠杆菌16S rDNA的保守基因片段，设计引物，引物序列与反应体系参照文献方法进行[2]。

1.5  血清型鉴定  采用大肠杆菌单因子标准阳性血清，与分离菌株的菌体抗原进行玻璃板凝集反应。

1.6  药物敏感性试验  采用K-B纸片扩散法进行药物的敏感性试验，参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLC）标准进行操作与判断。

1.7  致病性试验  采用腹腔注射法，将调到3×108CFU/mL的菌液，注射7日龄雏鸡0.5mL/只，设不注射和注射生理盐水的对照组两个，每组6只雏鸡。观察雏鸡死亡情况，并取死亡鸡只病变组织，分离菌株与原菌液菌进行比较。

2  结果

2.1  细菌的分离培养  细菌的分离培养结果见图1。

样品液在麦康凯平板长出光滑、红色的菌落，（图1A），在伊红美蓝琼脂上长出了带有金属光泽的菌落，划线分离出一株菌株，命名为JZE01。将JZE01在营养肉汤里培养后出现浑浊，革兰氏染色镜检为红色的两端钝圆的长杆菌（图1B），符合大肠杆菌形态。

2.2  生化鉴定  JZE01菌株生化反应鉴定结果见表1。

由表1可知，该菌可以发酵糖，吲哚试验、甲基红试验阳性，不产生H2S，初步鉴定JZE01为大肠杆菌。

2.3  PCR鉴定  将JZE01菌株菌液进行16S rDNA基因扩增得到与预期基本一致的片段，约1450bp。回收测序，进行BLAST比对，与大肠杆菌同源性为99.92%。

2.4  血清型鑒定  利用“O”抗原标准血清进行鉴定，JZE01菌定型为O2。

2.5  药敏试验  选取常见的抗菌药物12种，对菌株JZE01进行药物敏感性试验，试验结果显示JZE01株对头孢类、喹诺酮类等8种药物耐药，对妥布霉素、阿米卡星高敏，对强力霉素、氧氟沙星中敏，表明分离株JZE01对多种药物具有耐药性。药敏试验结果见表2。

2.6  致病性试验  腹腔注射菌苗后的雏鸡，6h后出现精神不振、怕冷扎堆、食欲降低甚至废绝，很少饮水，并出现白色稀粪，在21、33、69h检查各死亡2只，剖检病死鸡发现气囊浑浊增厚，心包有积液，包膜增厚，有纤维素性渗出物，肠道出血，有粘性渗出物。对照组生长正常，未出现任何症状。回收死亡鸡组织，分离到与原接种菌一致的菌株。

3  讨论

大肠杆菌是一种条件性致病菌，在规模化肉鸡养殖场的鸡舍中，从舍内环境、裸露饲料、饮水和粪便等来源中均可以分离到该菌，它的血清型复杂，其中的致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli， APEC）给肉鸡养殖业带来了严重的危害，特别是当肉鸡群发生病毒性疾病或者支原体病时，可以造成肉鸡死淘率增加[2-4]。据调查规模化白羽肉鸡养殖场发生大肠杆菌病的主要原因：一是环境因素突变引起的鸡群应激，当外界气温骤升骤降或者刮起大风，鸡舍没有及时调节通风小窗的大小，造成局部温度高于或者低于设定温度，时间长久导致鸡群抵抗力下降，诱发大肠杆菌病;二是鸡场发生其它疫病的时候，比如发生支原体病或者新城疫时，鸡群免疫功能降低，发生与大肠杆菌病的混合感染或者继发感染;三是饲料和饮水中含有大肠杆菌，规模化的鸡场应该定期对饲料和饮水进行大肠杆菌指标检测，一旦发现指数超标，就要停止使用，在清除原因后再进行饲喂或者饮水;四是粪便中的大肠杆菌引起，鸡的粪便中含有致病性大肠杆菌，可以通过其它途径感染鸡群，这与粪便清理的速度密切相关，要求鸡舍每日清理粪便，特别是在炎热的夏季。