应用微卫星标记评估寿光鸡的保种情况

李惠龙

摘  要：寿光鸡是国家级地方优良品种，原产于山东省寿光市，具有重要的保种价值。本研究利用微卫星标记检测两个不同保种场寿光鸡群体的遗传多样性，评估群体遗传资源现状和保种场的保种效果。结果表明：在来自山东寿光慈伦种鸡养殖场与中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地的两个寿光鸡群体中，5个微卫星标记共有等位基因53个，各微卫星标记的等位基因数为8～15;2个群体中5个微卫星位点的平均多态信息含量（polymorphism information content，PIC）分别为0.543 和0.465，平均杂合度（heterozygosity， H）分别为0.601 和0.523，说明各群体的遗传多样性较为丰富;2个群体间相似性系数为0.9678，Nei氏遗传距离为0.0328，UPGMA聚类结果将2个群体聚为1类，与白洛克群体明显分开，表明2个群体遗传相似性很高。研究表明两个不同保种场的寿光鸡的保种效果良好，但在遗传多样性上仍然存在一定差别，可能是保种群体大小和保种方法的不同所致，为寿光鸡这一地方品种的保种提供了部分参考与依据。

关键词：微卫星;寿光鸡;保种;杂合度（H）;多态信息含量（PIC）;聚类分析

中图分类号：S813.1    文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2020）5-0003-05

我国拥有品种众多、分布广泛的地方鸡种，其遗传多样性非常丰富。但由于保种的方法不当，以及盲目引进外来品种与地方品种进行杂交，造成了我国许多优秀的地方鸡种的数量和种类大量减少，对地方鸡种遗传资源的检测与管理亟待加强。寿光鸡是国家级地方优良品种，原产于山东省寿光市，属肉蛋兼用型。寿光鸡具有耐粗饲、觅食力强、遗传性稳和抗病力强的特点，是著名的山东地方鸡种。早在1960年，国家就在山东省寿光市慈伦种鸡场建立了保种场以保护寿光鸡。中国农业大学于2000年从山东省寿光市慈伦种鸡场引进了一批寿光鸡进行保种。两个群体分别在不同地区、不同饲养条件下进行活体保种，本研究拟对两个寿光鸡群体的群体结构进行分析，同时了解其保种效果。

微卫星（microsatellite），又称简单序列重复（simple sequence repeats，SSR），一般以1～6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。微卫星具有高度的多态性和保守性，重复性好，等位基因数目多，呈等显性遗传，并且检测方便等特点[1]。目前已开发出大量的微卫星标记，并广泛用于畜禽遗传图谱的构建、基因定位、群体遗传结构分析等研究。本研究拟利用微卫星标记分析寿光鸡在不同保种场的群体结构，分析其遗传多样性及保种效果，为地方鸡保种选育与利用提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料  试验所用寿光鸡分别来自山东省寿光市慈伦种鸡养殖场与中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地，每个场各选取60只鸡，在本试验中分别记为寿光-SG、寿光-CAU，选取60只白洛克作为参考群体。每只鸡翅下静脉采血1mL，置于盛有EDTA抗凝剂的离心管中。使用血液基因組DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京），并按其说明书步骤提取每只鸡的基因组DNA，用1.0%凝胶电泳检测DNA完整度，使用分光光度计DS-11 测定浓度。

1.2  微卫星引物筛选及PCR扩增  根据参考文献[2-3]中提供的鸡微卫星序列及引物，选择出ADL267、LEI194、MCW295、MCW34、LEI228 5个微卫星标记进行分析。微卫星位点信息见表1。

PCR反应体系（20μL）：10×Taq Buffer 2.5 μL，上下游引物（5pmol/L）各0.2μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，dNTP（0.2mmol/L）2μL，DNA（50ng/μL）2μL，ddH2O补齐至20μL。PCR扩增反应程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，52～64℃退火35s，72℃延伸40s，共35个循环，72℃延伸10min。

PCR产物检测：采用ABI3730XL DNA分析仪对PCR产物进行毛细管电泳，检测片段大小信息，上样总体积10μL，其中上样液Hi-Di Formamide （高质量的去离子甲酞胺）7.5μL，GS-500标准内参0.5μL，混合PCR扩增产物2μL。

1.3  数据分析  通过GeneMapperV4.1软件分析各目标片段大小，判断纯合子或杂合子;利用Microsatellite-Toolkit算等位基因数、等位基因频率、杂合度（heterozygosity，H）、多态信息含量（polymorphism information content，PIC）。利用 Popgene32V1.31软件对3个鸡群体间的Nei氏遗传距离和遗传相似性进行分析，根据遗传距离，采用UPGMA法进行聚类。

2  结果与分析

2.1  微卫星标记的等位基因及基因频率  各微卫星标记在不同群体中均表现出不同的多态性，结果见表2～6。每个微卫星标记的平均等位基因数为10.60，平均有效等位基因数为3.46。各微卫星标记的等位基因数为8～15，5个微卫星标记共有等位基因53个。位点LEI228的等位基因最多，共15个;而位点ADL267、MCW295、MCW34的等位基因均为8个。各标记等位基因数在各群体间是有差异的，等位基因数相同的标记其等位基因的基因频率也是不同的。

2.2  群体内多态信息含量与杂合度  寿光-SG、寿光-CAU与白洛克这3个群体的多态信息含量（PIC）如表7所示。对于所有群体，各位点的PIC平均为0.648;遗传信息含量最低的是寿光-CAU，为0.465;最高的是白洛克，为0.704。寿光-SG与白洛克属于高度多态（PIC>0.5），寿光-CAU属于中度多态（0.25

群体杂合度（H）表示在被检测基因座上群体中杂合子的频率，它是群体杂合程度的度量单位。群体平均杂合度的大小反映了群体的遗传一致性程度。群体的杂合度越小，反映该群体的遗传一致性越高，而群体的遗传变异程度就越低，群体的遗传多样性越差。寿光-SG的杂合度为0.601，寿光-CAU的杂合度为0.523，白洛克杂合度为0.746。白洛克的杂合度最高，而寿光-CAU群体杂合度最低，见表7。

2.3  群体间的遗传变异分析

2.3.1  遗传距离和遗传相似系数  遗传距离与遗传相似系数均是反应群体遗传变异的指标[4]。遗传距离表示群体间的遗传差异，遗传相似系数主要表示群体间的相似程度，遗传距离越小，其遗传相似系数越大。

由表4可以看出，寿光-SG、寿光-CAU与白洛克的遗传距离较大，分别为0.4132和0.4691，而2个寿光鸡群体之间的遗传距离为0.0328，远小于寿光鸡与白洛克的Nei氏遗传距离。遗传相似系数方面，寿光-SG与寿光-CAU相似系数为0.9678。

2.3.2  聚类分析  根据群体间遗传距离，使用UPGMA方法构建系统聚类图1。

从聚类的结果（图1）可以看出，寿光鸡的2个群体聚在一起，而被用于对照的白洛克则单独成为一类。这进一步说明了寿光-SG、寿光-CAU这两个群体的遗传关系很近，并与遗传背景差异较大的白洛克相比形成了差异。

3  讨论

微卫星通常应用于物种遗传多样性分析、保种效果监测、杂种优势预测等方面，能够反映群体内的遗传变异情况，同时也可以作为群体间的划分依据。在家禽的相关研究中，王利刚等利用微卫星标记对13个鸭品种进行了遗传多样性分析[5]，反映了我国各地方鸭种的遗传多样性差异;方倩倩等（2016）利用微卫星标记对我国太湖鹅进行了保种效果的检测[6];黄勋和（2017）以岭南黄鸡为参照，利用微卫星位点检测贵妃鸡和麒麟鸡的遗传多样性，并评估了群体遗传资源现状[7]。研究发现，在配套系鉴定的微卫星选择过程中，使用ADL267、LEI194、MCW295、MCW34、LEI228、ADL172 6个微卫星标记所获得的群体遗传结构与使用20个微卫星所得到的结果类似，这6个微卫星标记可以将不同品系进行区分[3]。这说明本研究所选用的微卫星标记有能力鉴定出家禽的不同品系和分析群体遗传结构，可以用于寿光鸡保种效果的鉴定。

本研究利用5对微卫星标记分析来自山东省寿光市慈伦种鸡养殖场与中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地两个寿光鸡群体的遗传多样性和保种情况。一般认为，PIC大于0.5，说明群体遗传多样性较高，反之则较低[8]。本次研究结果显示寿光-SG（山东省寿光市慈伦种鸡场）的位点平均为高度多态（PIC>0.5），寿光-CAU（中国农业大学）的位点平均为中度多态（0.25

两个寿光鸡群体均具有比较丰富的遗传多样性，说明山东省寿光市慈伦鸡场与中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地的保种效果良好。此前有研究认为，两个品系间的遗传距离小于0.030时，可以将其视为一个同一品系[9]。中国农业大学动物科技学院家禽遺传资源与育种试验基地的寿光鸡是2000年左右从山东省寿光市慈伦种鸡场引进，经过15年的隔离，两寿光鸡群体间的遗传距离为0.0328，遗传相似系数为0.9678。两个寿光鸡群体间的遗传距离远小于甘肃省静宁县和宁夏回族自治区固原市的2个静原鸡群体间的遗传距离0.0876[10-11]。在一个有限的闭锁群体内，群体的近交系数将随着繁育世代的增加而逐渐上升，群体基因杂合度将存在一定程度地下降，群体内的遗传变异或遗传多样性逐渐降低[12]。因此虽然两个寿光鸡群体虽然来源相同，但其多态信息含量与杂合度有所不同，这可能是由群体大小和保种方法的差异造成的。两群体基因交流可能会更有利于寿光鸡的保种。

4  结论

本研究利用ADL267、LEI194、MCW295、MCW34、LEI228 5个微卫星标记分析了来自山东省寿光市慈伦种鸡养殖场与中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地的寿光鸡的遗传结构、群体间的遗传变异情况，一方面表明了寿光鸡群体遗传多样性丰富，具有较高的保种价值;另一方面表明两地的保种情况均能有效保护寿光鸡的遗传多样性，同一品种的异地保种可以为品种的保护与利用提供了方法借鉴。

（致谢：感谢中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地友情提供样品。）

参考文献：

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[6]  方倩倩，劉雅丽，李祥龙，等.利用微卫星标记技术分析太湖鹅保种效果[J].畜牧与兽医，2016，48（12）：19-24.

[7]  黄勋和，张金枫，陈洁波，李威娜，钟福生，杜炳旺. 贵妃鸡与麒麟鸡微卫星遗传多样性研究[J]. 中国畜牧杂志，2017，53（02）：30-35.

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Abstract：Shouguang Chicken is a national-level local variety，native to Shouguang city， Shandong province，with important conservation value.This study used microsatellite markers to detect the genetic diversity of two different groups of Shouguang Chicken，to assess the status of population genetic resources and the conservation efficacy of the species.The results showed that 5 microsatellite markers had 53 alleles in two Shouguang Chicken populations from the Shandong Shouguang Cilun Chicken Breeding Farm and the College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，the number of alleles of each microsatellite marker was 8～15，and the average of 5 microsatellite loci in 2 populations was average.The average polymorphism information content （PIC） of 5 microsatellite markers in the 2 populations were 0.543 and 0.465 respectively，and the average heterozygosity （H） were 0.601 and 0.523，respectively，which indicated that the genetic diversity of the two populations was relatively abundant;the similarity coefficient between the 2 populations was 0.9678，Nei's genetic distance was 0.0328，and the UPGMA clustering results gathered 2 groups into 1 groups，indicating that the genetic similarity of the 2 populations is very high.The study shows that the 2 different populations of Shouguang chicken have effectual preservation，but there are still some differences in genetic diversity，which may be the result of the difference between the size of the species and the method of preserving.It provides some reference and basis for the preservation of this local species of Shouguang chicken.

Key words：Microsatellites;Shouguang chicken;Breed conservation;Heterozygosity（H）;Polymorphism information content（PIC）; Cluster analysis