井穴放血对大鼠脑梗死缺血再灌注损伤的脑保护作用

高靓 潘玥 赵贵捷 徐梦瑶 孟雪

(天津中医药大学第一附属医院针灸临床部 国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300193；2天津中医药大学)

缺血性脑卒中发病机制多样，现有的研究虽然已经在缺血性脑卒中病理机制方面取得进步，但基础研究成果依然无法向临床转化，现临床使用的神经保护药也只是清除氧自由基，治疗效果不佳〔1,2〕。使用重组组织型纤溶蛋白酶激活剂静脉溶栓是脑梗死主要治疗手段，但该治疗有严格的时间窗，存在较高的致命性出血风险，限制应用〔3〕。因此根究缺血性脑梗死具体病理机制，探讨一种新型的、合理的、有效的脑梗死治疗手段，对挽救缺血半暗带意义重大。针刺在我国已有多年的应用历史，研究发现，针刺用于缺血性脑卒中的治疗能够促进缺血性脑损伤后神经功能的重塑与修复，这可能与针刺对脑出血再灌注损伤后内源性神经干细胞激活作用有关〔4〕。但现有的研究多集中于针刺对缺血性脑卒中恢复期的影响，在急性期的使用价值尚未见较多报道。刺络放血疗法是针刺的一种方式，井穴放血治疗能够提高大鼠缺血区脑组织抗应激能力，有一定的脑保护作用〔5〕。本研究观察井穴放血对大鼠脑梗死缺血再灌注损伤的脑保护作用。

1 材料与方法

1.1动物 自北京维通利华实验动物技术有限公司购入清洁、健康的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠90只，周龄均为8 w，体重0.24～0.26 kg；平均(0.25±0.01)kg。术前将大鼠置于安静的环境中饲养，5只一笼进行饲养，喂养饲料为全价颗粒，大鼠均在12 h的光照与黑暗周期内自由进食饮水。

1.2试剂 北京生物技术公司提供的水合氯醛，上海化学试剂公司提供的多聚甲醛、枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、3%过氧化氢、过硫酸铵，美国Sigma公司提供的显色液、一抗稀释液，石家庄第一制药厂提供的生理盐水、无水乙醇、多聚赖氨酸、75%酒精；天津化学试剂三厂提供的异丙醇，北京完达山提供的脱脂奶粉，美国Pierce公司提供的蛋白定量试剂盒、兔抗Caspase-3抗体、羊抗兔抗体等。

1.3实验主要仪器 美国Stoetling公司提供的51600型脑立体定位仪，山东新华医疗器械提供YX0602型蒸汽消毒器，日本岛津提供VX4200S型动物电子秤、BX63型自动显微镜扫描仪、离心机、各显微手术器械，黄石恒丰医疗器械提供的恒温器，北京医疗器械厂提供的石蜡切片、外科手术各器械、微量移液器，日本Sanyo公司提供的超声波细胞碎破仪，石家庄医疗器械提供的恒温水浴箱、干燥箱、超声工作台、培养箱、混合器，上海医疗器械厂提供的恒温烤片机、DYY-12型电泳仪与DYCZ-24DN型电泳槽，北京中山生物提供的多功能酶标仪，德国Eppendorf公司提供的微量移液器，美国Syngene公司提供的超低温冰箱，北京六一仪器提供的制冰机，美国Imaging公司提供的图像分析系统，日本OLYMPUS提供的数码相机。

1.4模型建立与分组 实验开始前使用抽签法对90只大鼠进行随机分组，假手术组、模型组、井穴放血0、1、3、6 h组各15只。其中假手术组大鼠麻醉后，仅仅分离其右侧大脑中动脉，不将线栓插入；模型组麻醉后向右侧大脑中动脉插入线栓阻塞血管，并在1 h后将线栓拔出，血流恢复，成功制备大脑中动脉阻塞大鼠模型；井穴放血各组采用与模型组相同的方法制备大脑中动脉阻塞模型，并分别于梗死缺血再灌注后0、1、3、6 h，给予井穴放血治疗，治疗时间均为3 d。处理均符合《关于善待实验动物指导性意见》〔6〕中相关意见。

1.5井穴放血 选穴：选择位于大鼠两侧前肢趾端井穴，每侧选择穴位6个，包括少商、中充、少冲、商阳、关冲、少泽，使用1.7 cm(0.5寸)毫针在各穴位上点刺放血1～3滴。

1.6神经功能损伤 采用Longa评分法评价大鼠的神经功能损伤情况〔7〕，0分：肢体功能正常；1分：提尾实验前肢无法完全伸直；2分：行走时有瘫痪情况，肢体向瘫痪侧转圈；3分：大鼠瘫痪，站立时向肢体瘫痪侧摔倒；4分：大鼠无法站立行走，有意识障碍。分值越高提示神经功能损伤越严重。

1.7梗死面积 大鼠均给予水合氯醛致死量腔内注射，将脑取出置于缓冲液中3 min，后将脑转至脑切片机内切片，规格为1 mm，并浸入2%2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)中5 min。切片置于10%甲醛溶液内，4℃过夜。TTC属于物色染料，经该染色后健康的组织呈红色，反之无染色为梗死区。扫描仪扫描采集图像，经图像分析软件分析比较，为保证结果的可比性，应取各大鼠相同部位脑组织脑片，经扫描后的白色区域判定为坏死核心区，各切片梗死面积检测3次，取平均值。注意测量期间任一无法确定梗死的区域均不纳入。

1.8其他脑组织相关指标表达 制作石蜡切片，经苏木精-伊红染色观察大鼠海马CA1区神经元水肿及坏死情况；经免疫组化测定大脑胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞、星形胶质细胞中Neun阳性细胞表达及Caspase-3阳性细胞的数量；同时采用Western印迹测定大鼠CD11b蛋白表达。

1.9统计学方法 应用SPSS20.0软件行方差检验。

2 结 果

2.1Longa评分与梗死面积 假手术组无梗死病灶，无神经功能异常与肢体瘫痪；模型组与井穴放血各组均有不同程度梗死病灶、神经功能缺损症状，其中模型组Longa评分最高、梗死面积最大，后由高至低依次为井穴放血6、3、1、0 h组，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2脑组织主要细胞与蛋白表达 假手术组GFAP阳性细胞、Caspase-3阳性细胞、CD11蛋白表达均最低，Neun阳性细胞表达最高；后依次为井穴放血0、1、3、6 h组，模型组GFAP阳性细胞、Caspase-3阳性细胞、CD11蛋白表达均最高，Neun阳性细胞表达最低，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组Longa评分与梗死面积、脑组织主要细胞与蛋白表达比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与井穴放血0 h组比较：3)P<0.05；与井穴放血1 h组比较：4)P<0.05；与井穴放血3 h组比较：5)P<0.05

3 讨 论

脑梗死是因脑组织血流量灌注减少导致脑神经组织凋亡或功能障碍的一种疾病，这类患者神经功能障碍主要有视野缺损、反射减退、精神症状、麻木等。缺血性脑梗死在全部脑梗死中占比约为85%，主要因大小血管动脉粥样硬化、心脏起源性栓塞、小血管闭塞、全身低灌注等原因导致〔8〕。目前，缺血性脑梗死的治疗除了重组组织型纤溶酶原激活剂的应用之外，尚未发现其他有效的治疗手段能够扭转或抑制患者脑损伤，且在缺血性脑梗死神经保护的相关研究尚未得到让人满意的进展〔9〕。可见，缺血性脑梗死的早期有效治疗依然是临床研究的难点。

细胞凋亡、坏死、免疫调节、炎症、兴奋性氨基酸、氧化应激、营养因子撤退等均是脑缺血级联反应发生的主要机制〔10〕。故针对缺血性脑梗死的发生发展有必要找到一种有效的神经保护治疗手段。脑梗死在祖国传统医学中属脑中风范畴，中医认为瘀血阻络、脉络受阻是疾病发生发展的基本病因，可导致肢体偏瘫、半身不遂等情况，因瘀血阻滞、脉络闭塞，引起血液循环不畅，经脉气机无法正常运行，则肢体得不到濡养，故而诱发肢体麻木、废痿不同等情况〔11,12〕。可根据疾病的中医发病机制为其采用祛瘀通络、通筋活络的治疗原则。放血疗法在我国历史悠远，《素问·血气行志》中提到“凡治病因先去其血”，在《针解》中提及了放血疗法“苑陈则除之者，恶血出也”，故可以考虑给予脑梗死缺血再灌注损伤患者放血疗法治疗〔13〕。但目前与之相关的研究并不多见，特别是在发病早期的应用更为少见。

放血疗法的实施选穴极为关键，本研究中所选十二井穴是十二经脉出处最浅之处，是各个经络连接微循环的连接点，对其进行刺络放血治疗，有着“根有根本，终有终结”的价值。具体的十二井穴主要指四肢末端井穴，连接了头面部各个相关部位，故头面部、躯干各部位疾病均可以针刺十二井穴治疗〔14,15〕。井穴放血治疗可以帮助经络内瘀阻的瘀血去除，增加脉络中缓慢流行血流的速度，达到改善缺血再灌注损伤的目的。本研究结果证实，井穴放血治疗对脑梗死缺血再灌注损伤的脑保护价值，且越早对大鼠进行干预，其脑保护效果越好。早期井穴放血治疗对脑梗死缺血再灌注损伤带来的脑保护作用更为理想，这与阮建国等〔16〕研究结果一致。井穴放血疗法对脑梗死后缺血再灌注损伤的脑保护机制可能与细胞内钙离子超载、自由基堆积、兴奋性氨基酸毒、炎症因子异常表达等有关，兴奋性氨基酸在脑缺血发生时大量释放，聚集在胞外，因能量缺乏，机体对氨基酸的重摄减少，导致大量钙离子内流，故而加速神经细胞的坏死；而在井穴放血治疗后，可增加机体对氨基酸的重摄，减少钙离子内流，从而延缓神经细胞坏死〔17,18〕。