湖南中部地区住院结核病患者主要流行菌株及耐药情况

陈伟 刘红波 肖小红 吴莹

结核分枝杆菌作为与人类共同进化最为成功的病原体之一，感染了世界1/4 的人口。2017年，世界新发结核病900 万例，130 万例死亡（包括30万艾滋病毒感染者），而我国新发结核病例占世界的9%，耐药结核占世界的13%[1～3]，目前结核病的疫情和防控形势十分严峻。结核病是由结核分枝杆菌引起的，以气溶胶形式通过呼吸道在人与人之间传播。结核分枝杆菌在环境中分布广泛，不产生毒素，具有特殊的细胞壁结构，含丰富的脂质，对外界环境和药物有很强的抵御能力。本研究拟通过收集在我院传染科住院治疗的结核病患者资料和痰液标本，了解本地区结核病的主要流行菌株和耐药情况，为本地区的结核病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2016年10月～2019年10月在我院传染科住院治疗的痰涂阳性结核病患者217例，收集患者基本资料（性别、年龄、病史等），并于清晨采集痰液进行分离培养：痰液中加入4%氢氧化钠充分溶解，并均匀接种于酸性罗氏培养基上，37℃温箱培养3～4 周。

1.2 主要试剂与仪器异烟肼（H）、利福平（R）、链霉素（S）、乙胺丁醇（E）、7H9 液体培养基购自美国Sigma公司；分枝杆菌酸性罗氏培养基及药敏实验培养基由本实验室自行制备；Tap DNA 聚合酶、dNTP、引物购自大连宝生物科技有限公司；TGradinent PCR 仪购自美国Bio-RAD公司；电泳仪及凝胶电泳成像系统购自北京君正医疗设备有限公司。国际标准株H37Rv作为参照菌株（中国疾病预防控制中心提供）。

1.3 药物敏感性试验采用比例法进行药物敏感试验，取分离培养2～3周的新鲜菌落，加入含0.5%吐温-80 的生理盐水中，充分混匀，与标准麦氏比浊管（MacFarland No.1）比浊，配成1mg/ml 的菌液浓度。用22 SWG 的标准接种环配成2～10mg/ml 菌液，均匀接种于含异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇的培养基表面，置于37℃培养箱中，4 周后观察结果。

1.4 结核分枝杆菌总DNA提取采用热裂解法提取总DNA，从分离培养基上刮取适量菌体溶于蒸馏水，漩涡振荡器上振荡使菌落溶解均匀。于80℃灭活30min，8 000r/min 离心。弃上清后加400μl TE混匀，100℃ 30min，离心后取上清，-20℃保存备用。

1.5 “北京家族”菌株的鉴定采用RD105 缺失基因检测法鉴定“北京家族”菌株，上游引物F：5'-CG TGCACAGTTGCGTGTGTA-3'；下游引物R：5'-CGT CGTATTCTGCCGATACT-3'。PCR扩增产物长度为266bp。PCR反应体系：Tap DNA 聚合酶0.5μl，dNTP 2.0μl（2.5mmol/L），引物各0.5μl，模板DNA 2.0μl，Buffer 2.5μl。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，70℃ 45s，共40个循环；72℃延伸10min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 检测阳性说明存在RD105 基因，缺失则为“北京家族”菌株。

1.6 统计学方法采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，计量资料以±s表示，进行t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RD105缺失基因检测法鉴定结果PCR扩增产物长度为266bp，1号为国际标准株H37Rv，2～5号为“北京家族”菌株，6号为非“北京家族”菌株，见图1。

图1 RD105 缺失基因检测法鉴定“北京家族”菌株

2.2 痰涂阳性住院患者基本资料本地区住院治疗的结核病患病人群以老年男性（＞60岁）为主，男性患病率明显高于女性，为女性的2.24倍。本地区结核分枝杆菌流行菌株为“北京家族”基因型（66.8%），“北京家族”基因型流行趋势在年龄、性别、初治和复治患者中差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 住院治疗的结核病患者基本情况[n（%）]

2.3 临床分离株耐药情况217例临床分离株中总耐药率为37.8%，其中耐链霉素（S）24.9%、耐异烟肼（H）23.5%、耐利福平（R）16.6%、耐乙胺丁醇（E）9.2%、耐多药（Multi-drug resistant，MDR）10.6%，耐药和耐多药在“北京家族”和非“北京家族”之间比较无差异，复治患者耐单药和耐多药率明显高于初治患者（P＜0.05）。见表2。

表2 217例临床分离株耐药情况

3 讨论

随着抗结核药物的大量使用，结核分枝杆菌在不断的进化以适应新的宿主环境，由于治疗不规范、不彻底导致耐药菌株不断出现，同时单耐药菌株向多耐药、耐多药和广泛耐药转变。这些耐药菌株的出现给临床治疗带来巨大挑战，同时也增加了防控难度，因此了解本地区结核病的流行情况及耐药情况对本地区的结核防治具有重要意义。“北京家族”菌株是世界范围内广泛流行的结核分枝杆菌分型，约占全部菌株的1/3，具有传播能力强、毒力高等特点[4，5]。在我国，大部分地区的报道感染率超过50%，尤其在北方地区高达90%以上。本研究显示：湘中地区“北京家族”菌株占全部临床分离株的66.8%，处于全国平均水平。“北京家族”菌株与耐药的相关性一直是结核病研究领域的热点。但研究结果并不一致，有研究认为“北京家族”与异烟肼、利福平以及MDR 耐药有关[6～8]，另外的研究发现非“北京家族”与链霉素耐药相关[9，10]，也有观点认为“北京家族”菌株与耐药无关[11]。本研究未发现“北京家族”与耐药有相关性，可能与样本量过少、药物敏感性检测的主观因素影响过大有关，下一步研究可以从基因耐药和“北京家族”菌株的相关性入手进行探讨。另外“北京家族”菌株与患者性别、年龄及治疗史均无明显相关性。

世界卫生组织报道2017年全世界新发结核病例男性为580 万，女性为320 万，男性和女性在结核病患病率上有明显差异，男性约为女性的1.81倍，其中俄罗斯达到4.93倍，大部分地区为0.8～1.13倍[12]。本研究发现在本地区结核病患者中男性为女性的2.24倍，高于世界平均水平。目前认为吸烟和饮酒可能是男性结核病患病率高的原因之一，WHO 报告显示20%的结核病患者有吸烟史，多项病例对照研究发现吸烟者的患病风险是非吸烟者的2.28～2.74倍[13～16]。有关饮酒与结核病的研究表明，在调整教育和吸烟的影响因素后，饮酒者的患病风险是非饮酒者的1.5倍[17]。最新的研究发现女性的中性粒细胞中平均表达水平较高的基因（n=682）与免疫反应和相关通路有关，而男性平均表达增加的基因（n=2 675）主要涉及细胞基本的生命过程，如RNA 转录和翻译[18，19]。女性通常表现出比男性更强的免疫力，这也可能是女性结核病患者数低于男性的重要原因之一。

药敏结果显示，本地区结核分枝杆菌临床分离株对一线抗结核药物的总耐药率为37.8%，其中耐链霉素（S）24.9%、耐异烟肼（H）23.5%、耐利福平（R）16.6%、耐乙胺丁醇（E）9.2%、耐多药10.6%，本地区总耐药率处于湖南省结核耐药平均水平，略高于全国耐药水平[20，21]。复治患者的总耐药率、单一耐药率、MDR 耐药率明显高于初治患者。直接督导短程化疗（Directly observed treatment for short course，DOTS）是世界卫生组织推荐的结核病控制策略，能够有效解决不合理、不规律用药问题，有效减少耐药结核病的产生。临床医生应严格按照DOTS 原则，管理和督促结核病患者，避免耐药性的产生，有效降低复治患者的耐药率。