感染白粉病烟株叶片真菌的群落结构与多样性

黄 宇，汪汉成，陈乾丽，向立刚，郭珍妮，李 忠，谢红炼，韩 洁

(1．贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081； 3.长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434025； 4.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025；5.贵州中医药大学 基础医学院，贵州 贵阳 550312)

烟草白粉病(Tobacco powdery mildew)是烟草生产过程中常见的真菌性气传病害[1]，其病原菌为二孢白粉菌(GolovinomycescichoracearumDC)[2-3]。该病主要危害成熟叶片，从下至上发展，发病初期病斑呈近圆形的白色霉斑，随后逐步扩展至整个叶片，严重时叶片正反面均覆盖白色粉状霉层，最后导致叶组织变黄、枯死[2]。感病烟叶烘烤后缺乏弹性和香味，病害严重时烟叶产量和品质损失高达80%[4-5]。目前已有诸多关于白粉菌侵染植物后导致植物微生物群落结构和多样性变化的报道。白维晓等[6]研究发现，感染白粉病后高抗蔷薇的真菌多样性降低，高感蔷薇的真菌多样性增加。罗路云等[7]研究表明，南瓜叶片感染白粉病后，随着病情等级的提高，Alpha多样性指数呈先降后升趋势。SUDA等[8]研究发现，黄瓜叶片感染白粉病后细菌数量、多样性和丰富度均增加。但关于烟叶感染白粉病后叶际微生物群落结构与多样性变化的研究却鲜有报道。

微生物多样性传统的分析方法是分离培养法，但自然环境中可培养微生物只占全部微生物的1%左右，因而传统的分离培养对揭示微生物的多样性存在明显的局限性[9]。高通量测序技术能够深入探索环境微生物的多样性及其功能，目前已被广泛应用于土壤[10-11]、水体[12]、肠道[13-14]及空气[15-16]等微生态系统的微生物多样性研究。为此，以感染白粉病烟株的发病烟叶和健康烟叶为研究对象，采用Illumina MiSeq 高通量测序技术研究叶际真菌的种群结构和多样性，旨在为烟草白粉病的科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 烟叶样品 2016年7月采于贵州省烟草科学研究院福泉基地。随机选取3株K326烟草白粉病典型烟株，剪刀经酒精消毒后分别剪取各烟株病级为7级的发病叶片和为病级0级的健康叶片样品[17]，发病烟叶(BFB)样品编号分别为BFAB、BFBB和BFCB，健康烟叶(BFJ)样品编号分别为BFAJ、BFBJ和BFCJ。样品采集后置入低温保藏箱，并迅速带回实验室，于-80℃冰箱中保存。

1.1.2 试剂及测序系统 FastDNA®Spin kit for Soil总DNA提取试剂盒，MP Biochemicals, Solon, OH, USA；Gene JET胶回收试剂盒，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA；Miseq PE300测序系统，上海美吉生物医药科技有限公司。

1.1.3 仪器设备 NanoDrop 2000超微量分光光度计，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA；peqSTAR PCR仪，PEQLAB Ltd., UK。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA提取、扩增及测序 将烟叶样品分别称取0.5 g研磨后，采用总DNA提取试剂盒抽提烟叶样品微生物基因组总DNA[18]，具体步骤按操作说明进行。提取完成后，使用NanoDrop 2000检测抽提DNA的浓度和纯度，纯度A260/A280要求在1.8～2.0[18]。

1.2.2 ITS文库构建及高通量测序 参照文献[19]的方法以样品DNA为模板，采用引物ITS1F (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)扩增目标片段的ITS区。PCR扩增体系和PCR反应程序参数参照VORHOLT等[19]的方法进行设置。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后送至上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina公司Miseq PE300平台进行高通量测序。

1.3 数据处理

参考[18-20]的方法，使用UPARSE(V7.1)根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，利用RDP classifier对每条序列进行物种注释，使用Unite(Release 6.0)真菌数据库进行分类注释。白粉病烟株上发病烟叶与健康烟叶的真菌群落结构及多样性评估包括：采用Mothur V1.30.1计算Alpha多样性指数，以反映微生物群落的丰富度与多样性；用Sobs指数和Chao1指数反映样本真菌群落丰富度，指数值越大群落丰富度越高；Shannon指数和Simpson指数反映样本真菌群落多样性，Shannon指数越大或Simpson指数越小则群落多样性越高；Coverage指数表示测序的覆盖度，其值越高样品中序列被测出的概率越高，测序结果的真实性越高[19]。群落Bar图可以直接反映各样本在门、属水平上含有真菌种类和样本中各真菌的相对丰度；Venn图用于统计多组样本中共有和独有的OTU数目，揭示健康烟叶与发病烟叶样本中OTU的数目组成相似性及重叠情况。常用稀释曲线(Rarefaction curve)检查测序结果是否合理。以上分析均在上海美吉生物医药科技有限公司I-Sanger生信云网站平台(http://www.i-sanger.com/project/index.html)完成。

4)C=1-(n1/N1)

式中，Sobs为实际观测到的OTU数，n1为只含有1条序列的OTU数目，n2为只含有2条序列的OTU数目，ni为第i个OTU所含的序列数，N为所有的序列数，C为Coverage(覆盖度)，N1为抽样中出现的总序列数目。

2 结果与分析

2.1 ITS序列的测序深度与数据质控

从封2图Ⅰ看出，6个样本的稀释曲线随样本读取数增加均呈升高趋势，其中，BFAJ、BFBJ和BFCJ的曲线急剧上升趋势，BFAB、BFBB和BFCB在样本读取数≤5 000时呈急剧上升趋势，之后逐渐趋于平缓。表明，测序已趋于饱和，测序深度已经足够，测序数据量足以反映样品中绝大多数的真菌多样性信息。原始序列经优化处理后，白粉病烟株的6个样本共得到225 011条高质量序列片段，64 057 651个碱基，单一样本序列数在31 110～43 785条，序列平均长度为280 bp。发病烟叶3个样本共测得高质量序列片段114 714条，碱基32 443 971个，单一样本序列数在31 129～43 785条，序列平均长度为230 bp。健康烟叶3个样本共得到110 297条高质量序列片段，31 613 680个碱基，单一样本序列数在31 110～40 167条，序列平均长度为206 bp。

2.2 OTU聚类

从表1看出，在97%的相似度水平对样品序列进行OTU聚类，白粉病烟株发病烟叶样本共鉴定出4个门10个纲13个目16个科20个属27个种29个OTU的真菌；白粉病烟株健康烟叶样本共鉴定到6个门23个纲41个目57个科86个属104个种136个OTU的真菌。从封2图Ⅱ看出，在属水平上，白粉病烟株健康烟叶的真菌种类远高于发病烟叶。发病烟叶独有假尾孢菌属(Pseudocercospora)、毛孢子菌属(Trichosporon)、Meyerozyma和异茎点霉属(Paraphoma)等共计4个真菌属；健康烟叶独有节担菌属(Wallemia)、单端孢属(Trichothecium)、Zymoseptoria、外囊菌属(Taphrina)和Umbilicaria等共计70个真菌属；二者共有的真菌属主要有枝孢属(Cladosporium)、青霉菌属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、念珠菌属(Candida)和镰刀菌属(Fusarium)等共计16个属。

表1 不同分类水平感染白粉病烟株健康与发病烟叶真菌群落的数量

Table 1 Community quantity of fungi in diseased and healthy leaves of tobacco plants infected with powdery mildew at different taxonomic levels 个

样本Sample门Phylum纲Class目Order科Family属Genus种Species操作分类单元OTUBFAB381113131415BFBB367781212BFCB3789101516Total4101316202729BFAJ5183243596686BFBJ4162633455156BFCJ4131926384657Total623415786104136

2.3 真菌群落的多样性指数

从表2看出，各样本的覆盖度指数均大于0.99，表明，样本序列被检出的概率较高，测序结果能够表示样本中实际的真菌群落结构。健康烟叶样本中真菌群落的Sobs指数、Chao1和Ace指数平均分别为66、102和119，均高于发病烟叶(14、21和28)。表明，白粉病烟株的健康烟叶真菌群落丰富度高于发病烟叶。健康烟叶样本中真菌群落的多样性指数Shannon和Simpson指数平均分别为0.321和0.850，发病烟叶为0.051和0.985。表明，白粉病烟株健康烟叶的多样性高于发病烟叶。

表2 不同组别真菌群落的Alpha多样性指数(OTU level)

2.4 真菌群落的基本组成

从封2图Ⅲ看出，在门水平上，发病烟叶(BFB)真菌群落的优势门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，分别占检出真菌总数的99.90%和0.09%；健康烟叶(BFJ)真菌群落的优势门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，分别占检出真菌总数的92.96%和0.11%。在属水平上，发病烟叶(BFB)真菌群落的主要菌属为高氏白粉菌属(Golovinomyces)、曲霉属(Aspergillus)和链格孢属(Alternaria)，相对丰富度分别为99.22%、0.33%和0.33%；健康烟叶(BFJ)真菌群落的主要菌属为高氏白粉菌属(Golovinomyces)、曲霉属(Aspergillus)和链格孢属(Alternaria)，相对丰富度分别为91.86%、0.34%和0.31%。从表3看出，发病烟叶(BFB)和健康烟叶(BFJ)真菌群落的丰富度前10位的优势属中，支顶孢属(Acremonium，0.05%)、新凸轮孢菌属(Neocamarosporium，0.05%)和Umbilicaria属(0.03%)为健康烟叶独有属，镰刀菌属(Fusarium，<0.01)和赤霉菌属(Gibberella，<0.01)为发病烟叶独有属，其余真菌所占比例不到总真菌数量0.1%的菌属，在各样品间的含量不存在差异。

表3 发病烟叶和健康烟叶样品真菌群落中前10位优势属的相对丰度

Table 3 Relative abundance of the top 10 dominant genera in fungal community of diseased and healthy tobacco leaves samples %

优势属 Dominant genus发病烟叶Diseased tobacco leaves健康烟叶Healthy tobacco leaves高氏白粉菌属 Golovinomyces99.2291.86曲霉属 Aspergillus0.330.34链格孢属 Alternaria0.330.31Rhodotorula0.090.06Unclassified-k-Fungi0.01-赤霉菌属 Gibberella<0.010.02Cladosporium<0.010.04镰刀菌属 Fusarium<0.01 -Unclassified-c-Dothideomycetes<0.01 -支顶孢属 Acremonium-0.05新凸轮孢菌属 Neocamarosporium-0.05 Umbilicaria-0.03其他 others0.010.16

3 结论与讨论

叶片是微生物栖息的重要场所，这些微生物在帮助寄主对抗病原体方面起着至关重要的作用[18]。近年来，叶片微生物逐渐受到关注，并在抗病原物研究中被广泛应用[19-20]。研究采用高通量技术对白粉病烟株的发病烟叶和健康烟叶真菌群落结构与多样性进行检测的结果表明，白粉病烟株健康烟叶的真菌群落多样性高于发病烟叶，其原因可能是白粉菌在发病烟叶中占较大优势，以致其他微生物种类减少。

经Alpha多样性分析，白粉病烟株的健康烟叶样品多样性指数和丰富度指数均高于发病烟叶样品，与前人的研究结果一致。ZHANG等[21]研究发现，黄杨白粉病发病叶片的真菌多样性低于健康叶片；SHANG等[22]研究发现，百合枯萎病样品的真菌多样性低于健康样品；TAN等[23]研究表明，连作三七感病样品根际土壤和根系的菌群多样性低于健康样品；肖婉钰[24]研究发现，黄龙病砂糖桔感病样品的菌群多样性低于健康样品。

研究结果表明，白粉病烟株发病烟叶与健康烟叶的真菌物种组成基本相似。门水平上，发病烟叶样品和健康烟叶样品的优势菌门均为子囊菌门，与其他感染白粉病植物报道一致。ZHANG等[21]发现，黄杨白粉病叶片真菌群落的优势菌门为子囊菌门；ZHANG等[18]报道，南瓜白粉病的优势菌门为子囊菌门。所有样本的真菌属类数较少，其中，高氏白粉菌属占优势。邢荷荷等[2，25]研究表明，高氏白粉菌属能引起烟草白粉病；曾晓葳[26]报道，早期植物病害的特点是绝大多数叶片甚至全部叶片均处于潜育阶段，当烟株感染白粉病后，发病烟叶和健康烟叶均携带白粉病菌，健康烟叶上高氏白粉菌属的相对丰度高达91.86%，但健康烟叶未表现出典型症状，后期可能表现典型症状。ZHANG等[21]发现，黄杨白粉病健康叶片的优势菌属为白粉菌属，其相对丰度高达48.68%。在健康烟叶与发病烟叶中存在相对丰度较高的链格孢属和曲霉属。裴洲洋[27]研究发现，链格孢属和曲霉属为烟草的内生真菌，其中链格孢属为优势菌属。方治国等[28]研究表明，空气微生物中也含有链格孢属和曲霉属。

利用Illumina MiSeq高通量测序技术对白粉病烟株的发病烟叶和健康烟叶样品进行测序分析发现，白粉病烟株健康烟叶的真菌种类和真菌群落多样性高于7级病级烟叶，虽然白粉病烟株健康烟叶未表现出典型症状，但其仍含有大量烟草白粉病的病原菌属(高氏白粉菌属)。结果将有助于人们了解烟株感染白粉病后，发病烟叶和健康烟叶的真菌群落结构和多样性，有利于烟草白粉病的科学防治。考虑到白粉病为真菌性气传病害，对其他烟叶真菌群落结构及多样性的影响较大，所以仅分析了感病烟株的真菌群落结构及多样性，并未对其细菌群落结构与多样性进行分析，后续将开展相关研究。