杜鹃兰化学成分、药理作用及质量控制研究进展

王 静，肖红琴，李 莹，胡贺佳，巩仔鹏，郑 林，王爱民，李勇军，李月婷*

(1.贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004)

杜鹃兰〔Cremastraappendiculata(D. Don) Makino〕属我国兰科的紧缺中药材，又名算盘七、三七笋，其干燥假鳞茎为主要的入药部位，性凉、味甘、微辛，被收载于《中国药典》中[1]，常在各种方剂中作君臣佐使药，如：紫金锭外敷治疗静脉炎时，杜鹃兰以散结泻热的功效作为君药[2]。菊藻丸联合化疗治疗中晚期胃癌时，杜鹃兰以清热解毒，软坚散结的作用助菊花、金银花等君药，作为臣药存在[3]。癃闭舒胶囊联同中药穴位贴敷治疗前列腺增生时，杜鹃兰以清热解毒、利尿通淋的作用为佐药使用[4]。杜鹃兰在中药配伍中起着重要作用，系统地研究杜鹃兰化学成分、药理作用对研究者开发新药及中药复方的临床深入研究具有重要意义。目前，杜鹃兰在化学成分、药理作用和质量控制方面的研究较多，已有的报道主要在化学成分及药理作用方面。但不同的化学成分提取溶剂不同。目前，鲜见有关杜鹃兰不同提取溶剂中化学成分及质量控制的报道。为此，从杜鹃兰不同提取溶剂提取的化合物、药理作用及质量控制3方面进行综述，以期为杜鹃兰有效成分的提取及临床应用的深入研究提供参考。

1 不同溶剂提取的化学成分

1.1 乙酸乙酯提取物

1.1.1 菲类化合物 LIU等[5]用95%的乙醇对杜鹃兰假鳞茎进行提取，结果从其乙酸乙酯层分离到5种菲类化合物，1种为苄基取代菲：cremaphe-nanthrene L，4种为菲苷类：cremaphenanthrene M、cremaphenanthrene N、cremaphenanthrene O、cremaphenanthrene P。LIANG等[6]从杜鹃兰95%乙醇提取的乙酸乙酯层中分离到5个菲类聚合物，分别为cremaphenanthrene A、cremaphenanthrene B、cremaphenanthrene C、cremaphenanthrene D和cremaphenanthrene E。LIU等[7-8]相继从杜鹃兰90%乙醇提取的乙酸乙酯层中分离到3个菲苷化合物，分别为7-羟基-4-甲氧基菲-2,8-二-O-β-D-葡萄糖苷、8-羟基-4-甲氧基菲-2,7-二-O-β-D-葡萄糖苷和2′,7′-二羟基-4,4′-二甲氧基-1,1′-联菲-2,7-二-O-β-D-葡萄糖苷。李小平等[9]通过使用柱色谱法、液相色谱等分离方法结合波谱技术，从杜鹃兰假鳞茎90%的乙醇提取物的乙酸乙酯层中鉴别出11个化合物，其中，2,2′,7,7′-四羟基-4,4′-二甲氧基菲-1,1′-二菲和7-羟基-2,4-二甲氧基菲为菲类化合物。

1.1.2 联苄类化合物 原文珂等[10]使用色谱分离法，在杜鹃兰90%乙醇提取物的乙酸乙酯层中鉴定出8个化合物，其中，shancigusim B和bulbocodin C为联苄类化合物。袁桥玉等[11]也采用相似的色谱法，在杜鹃兰乙酸乙酯层分离到10个化合物，其中，bulbocodin D为联苄类化合物。

1.1.3 黄酮类化合物 刘量等[12]通过波谱数据和文献对照方法，从杜鹃兰假鳞茎95%乙醇提取物中分离得到 13个化合物，其中，乙酸乙酯层的芫花素、槲皮素和槲皮素3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为黄酮类化合物，并首次分离得到。林松等[13]使用中低压柱色谱、大孔树脂柱色谱、高效液相柱色谱等方法，在杜鹃兰55%乙醇提取液中分离出23个化合物，其中橙皮苷、补骨脂宁、新补骨脂异黄酮和异补骨脂查耳酮为黄酮类化合物。

1.1.4 丁二酸苄酯苷类 WANG等[14]使用核磁共振波谱从杜鹃兰干燥假鳞茎的乙醇提取物的乙酸乙酯层中鉴别出4个丁二酸苄酯苷类，分别为1,4-二(4-β-D-吡喃葡萄糖苷苄基)-(2R)-2-苄基葡萄酸酯、1-(4-β-D-吡喃葡萄糖苄基)-4-乙基-(2R)-2-异丁基苹果酸酯、1-(4-β-D-吡喃葡萄糖苄基)-4-甲基-(2R)-2-苯基苹果酸酯和(-)-(2R,3S)-1-(4-β-D-吡喃葡萄糖苷苄基)-4-甲基-2-异丁基酒石酸酯。

1.1.5 其他类 除以上几类成分外，乙酸乙酯层中提取到的物质还含有生物碱类、脂肪族类、芳香类、氨基酸及其衍生物类等。刘量等[12]从杜鹃兰乙酸乙酯层中提取出的3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛和3-甲氧基-4-羟基苯乙醇为芳香类化合物。刘新桥等[15]用波谱技术鉴定出杜鹃兰乙酸乙酯层中含有的4-羟基-2-甲氧基苯-1-O-β-D-吡喃葡萄糖为芳香类化合物。原文珂等[10]从杜鹃兰90%乙醇提取物的乙酸乙酯层中鉴定出的间羟基苯甲酸、3-羟基苯丙酸和肉桂酸为芳香类化合物。

1.2 石油醚提取物

LIANG等[6]通过光谱数据与文献对比，在杜鹃兰95%乙醇提取物的石油醚层分离鉴定出2个菲类化合物，分别为2,7,2′-三羟基-4,4′,7′-三甲氧基-1,1′-联菲和2,2′-二羟基-4,4′,7,7′-四甲氧基-1,1′-双菲。刘量等[12]从杜鹃兰假鳞茎95%乙醇提取物的石油醚层分离出1个蒽醌类化合物，为大黄素甲醚。

1.3 氯仿提取物

林冰等[16]在研究杜鹃兰的脂溶性成分时，从杜鹃兰85%乙醇提取液的氯仿层中鉴定到8个化合物，包括3个甾体类化合物：β-谷甾醇、豆甾醇和β-胡萝卜苷；5个烷烃类化合物：二十九烷、三十烷-15-醇、三十烷醇、三十一烷十二醇和三十二烷醇。

1.4 水提取物

林冰等[17]通过将杜鹃兰干燥假鳞茎的85%甲醇提取液和85%乙醇提取液混合，用柱色谱法进行分离，结果从杜鹃兰水层分离出7个有机化合物，分别为蔗糖、三十二烷、正-三十四烷、三十六烷、十六烷酸、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯和酪氨酸。

1.5 正丁醇提取物

刘净等[18]在研究杜鹃兰的化学成分时，从杜鹃兰75%乙醇提取液的正丁醇层分离到1个联苄类化合物：5-甲氧基联苄-3,3′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，2个丁二酸苄酯苷类化合物： loroglossin和militarine，1个酚苷类化合物：天麻苷。

2 药理作用

2.1 抗肿瘤作用

LIU等[8]利用MTT法，将从杜鹃兰中分离得到的双菲苷类化合物进行细胞毒活性评价，结果表明，化合物2′,7-二羟基-4,4′-二甲氧基-1,1′-联菲-2,7′-二-O-β-D-葡萄糖苷对癌细胞BT474(IC50为16.7 μmol/L)和SKBR3(IC50为12.6 μmol/L)有中等抑制作用。刘银花等[19]发现，杜鹃兰水提取物对小鼠癌细胞4T1有明显的增殖抑制作用，且成剂量依赖关系。于林楠等[20]用MTT法对杜鹃兰乙醇提取物作用于人结肠癌细胞HT29的抑制率进行评估发现，杜鹃兰乙醇提取物对人结肠癌细胞HT29的凋亡有促进作用，大概与Cyt-C、Bax和Caspase-3的上调及Bcl-2 蛋白的下调有联系。徐小娟等[21]在研究杜鹃兰多糖对荷H22肝癌小鼠的影响时，通过制作小鼠H22肝癌模型，分析脾脏、胸腺指数对小鼠免疫器官的影响，检测血清白介素-2、肿瘤坏死因子的含量，免疫组化法观察Bcl-2的表达水平，结果表明：杜鹃兰多糖可增强小鼠血清白介素-2和肿瘤坏死因子的活性，抗凋亡因子 Bcl-2的表达随剂量的增加有所减少，且杜鹃兰多糖高、中、低剂量的抑瘤率分别为 30.76%、37.57%和43.74%，表明杜鹃兰多糖能增强小鼠对肿瘤的抑制能力。

2.2 抗血管生成作用

李余先等[22]分析了杜鹃兰乙醇提取物对新生血管的影响，结果表明HUVEC的增殖活性和CAM血管新生成的作用受到杜鹃兰乙醇提取物的抑制。homoisoflavanone为杜鹃兰乙酸乙酯层中分离到的一种黄酮类化合物[23]，KIM等[24]发现，视网膜新血管的形成受到抑制，主要与homoisoflavanone抑制HUVEC的生长及cdc2的低表达有关。此外，homoisoflavanone可使HUVEC的管腔和细胞迁移受到抑制作用，homoisoflavanone可以成为脉络膜血管新生的抑制剂，并作为新的抗血管生成抑制素[25]。

2.3 抗炎、抗痛风作用

HUR等[26]在研究杜鹃兰乙醇提取物乙酸乙酯层分离得到的Cremastrine 抗炎作用时发现，HaCaT细胞中的活性氧在受到紫外线照射时会起抑制作用； Cremastrine会降低MAPK的激活水平，下调环氧化酶-2的表达，并减弱核转录因子-κB的核内化，从而抑制白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子的生成。由于杜鹃兰的干燥假鳞茎中含有秋水仙碱，可使急性痛风性关节炎患者的关节疼痛在几个小时内得到有效缓解[27]。

2.4 抗菌作用

阮小丽等[28]将杜鹃兰甲醇提取物进行抑菌试验，结果表明，杜鹃兰甲醇提取物对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和表皮葡萄球菌有抑菌作用，其MIC分别为0.063 g/mL、0.125 g/mL和0.063 g/mL。黄小容[29]的杜鹃兰水层抑菌活性筛选试验发现，杜鹃兰水层的25%和75%的乙醇洗脱物可抑制金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。

2.5 M胆碱受体阻断作用

HAHN等[30]对cremastrine进行全合成，同时对其M胆碱受体阻断作用进行生物评价，结果表明cremastrine可以中等程度地抑制M1～M5 受体，其中cremastrine对M1和M5的作用最强，其IC50分别为2.8 μmo/L、10 μmo/L、10 μmo/L、10 μmo/L和4.0 μmo/L。由于杜鹃兰中含有化合物cremastrine，所以杜鹃兰也有M胆碱受体阻断作用。IKEDA等[31]通过光谱、化学分析和活性跟踪法，鉴别出杜鹃兰中的cremastrine(1)抑制了氚标记的东莨菪碱和M3 受体的结合，且亲和力为126 nmol/L。

2.6 降压作用

日本制药公司[31]在筛选毒蕈碱M3受体的过程中发现，杜鹃兰70%乙醇提取物的乙酸乙酯层分离出的cremastosine I和cremastosine II可作为M受体结合的抑制剂，当M受体与其结合后，会产生一种副交感兴奋作用，包括心脏活动的抑制，如：血压降低和心率下降等。薛震等[32]研究杜鹃兰化学成分时发现，犬静脉注射15 μg/kg的杜鹃兰素Ⅱ可以降低血压39 mmHg，且持续30 min以上。

2.7 对造血系统的影响

黄越燕等[33]通过复制小鼠再障模型，然后给予杜鹃兰复方制剂和生理盐水(对照)，以各组检测到的小鼠Hb、WBC、PLT、RET等指标为依据，分析杜鹃兰复方制剂对小鼠再生障碍性贫血的影响，结果表明，给予杜鹃兰的小鼠，其外周血细胞和骨髓造血功能均有增加现象，说明杜鹃兰对造血系统有促进作用。

2.8 对酪氨酸激酶的激活作用

酪氨酸酶存在于正常人体的皮肤细胞内，能将酪氨酸转变为黑色素，当人体缺少酪氨酸酶时，人体就会表现出白化症。为治疗色素障碍性皮肤病，闫军等[34]以酶促反应速度为依据，探究21种中药对酪氨酸酶活性的影响，结果有13种药对酪氨酸酶有上调激活作用(P<0.01)，杜鹃兰为其中1种。

2.9 其他作用

刘颖等[35]在研究杜鹃兰抗乳腺癌的作用机制时发现，杜鹃兰还有抑制癌细胞迁移的作用；李小平分析杜鹃兰化学成分时发现，杜鹃兰具有降糖和解痉镇痛等[36]作用。

3 质量控制

杜鹃兰的应用品种从古代本草记载到现在的药材市场一直都存在混乱现象，例如：名字混乱使用(金耳环和杜鹃兰是不同品种的药材，但金耳环沿用了杜鹃兰的别名，造成经营者分不清两者区别而在市场上混乱销售)[37]；一些伪品因与杜鹃兰花色、形态、花期、功效区别甚微，造成混用等等[38]，因此，研究者们从性状鉴别及理化鉴别等方面对杜鹃兰进行鉴别，以保证杜鹃兰的质量。

3.1 性状鉴别

杜鹃兰的假鳞茎呈不规则的卵球状，顶端有凹凸不齐的突起，基底部有不同形状的须根痕，长1.8～3 cm，膨大部约1～2 cm。表面不平整，有皱缩，为黄棕或棕褐色，断面为黄白或灰白色，有2～4个环带，质感较硬，带黏性，难折断，有淡淡的气味，喜欢阴湿环境，常生长在海拔-2 900 m以下的沟边阴湿地[39]。阮小丽等[40]使用显微镜对7种杜鹃兰药材进行鉴别发现，杜鹃兰有2～3层黄色壁细胞，内为薄壁细胞，含长约15～25μm的淀粉粒，近表皮的薄壁细胞有约15个长50～100 μm的草酸钙针晶束，25～100 μm的网纹导管或螺纹，脐点大多呈点状，淀粉多糊化，充满整个细胞。

3.2 理化鉴别

3.2.1 一般化学反应法 潘恒勤[41]分别用50%的乙醇浸泡杜鹃兰和独蒜兰粉末数小时，然后加入3～4滴醋酸铅溶液，结果装杜鹃兰样品的试管未产生白色沉淀，而装独蒜兰样品的试管产生白色沉淀。继续取2支干净试管，在装杜鹃兰和独蒜兰粉末的试管中加入水，并水浴20 min，各取上清液与碱性酒石酸铜溶液反应，结果2支试管都产生蓝白色沉淀并有粘结块，再将这2支试管水浴加热，试管中的粘结块都慢慢变成了砖红色，但装杜鹃兰样品的试管整个溶液都变成了砖红色。

3.2.2 薄层色谱法 吴永林[42]在做杜鹃兰和独蒜兰的薄层色谱时发现，使用不同的展开剂和显色剂，2种样品的现象不同。当以氯仿-甲醇为展开剂，以磷钼酸-乙醇液为显色剂时，在110°C下5～10 min就会显色，Rf=0.7的地方，独蒜兰有1个红色斑点产生，而杜鹃兰在相应位置没有红色斑点；当以正丁醇-丙酮-水为展开剂，苯胺-邻苯二甲酸为显色剂时，在110°下10～20 min就会显色，在Rf=0.55的地方，杜鹃兰和独蒜兰都有1个黄色斑点产生，但杜鹃兰的斑点大于独蒜兰。

3.2.3 分子鉴别 DNA条形码是一种通过与标准DNA片段进行对比来鉴定物种的技术，而rbcL基因序列又是DNA条形码研究的一种候选片段，由编码区和非编码区组成，rbcL基因有较高的分辨率，在生物学上常被用作分子标记，因此可用来鉴别植物的真伪[43]。牛宪立等[44]通过对杜鹃兰和伪品rbcL序列进行对比分析，结果显示杜鹃兰与秋花独蒜兰、陈氏独蒜兰和台湾独蒜兰分别有5个、3个和4个突变点，即rbcL碱基存在明显差异，可用来区分混品。

3.2.4 紫外吸收光谱 王珏等[45]使用紫外光谱对杜鹃兰和其伪品山兰进行生药学鉴别，总结出杜鹃兰正品的吸收峰在274 nm以上，而山兰的吸收峰在273 nm以下，可供质检人员质量鉴定。田昌海等[46]采用紫外吸收光谱法对不同产地的杜鹃兰和独蒜兰多糖进行含量测定，结果表明，杜鹃兰的含糖量一般比独蒜兰的含糖量低，且从数据结果显示，2008年的杜鹃兰多糖比2007年的杜鹃兰多糖含量高，猜测与样品的干燥度和储存时间有关。

3.2.5 高效液相色谱法 秋水仙碱是一种最初在百合科植物秋水仙中发现的生物碱，可以抑制细胞分裂，在临床上常作为抗癌药[47]和抗痛风药[48]使用，在农业上常作为植物育种使用[49]，我国也有研究者从杜鹃兰假鳞茎中提取出秋水仙碱[50]。袁理春等[51]采用HPLC法研究杜鹃兰鳞茎不同部位秋水仙碱含量时发现，杜鹃兰的地上部分基本没有秋水仙碱，而鳞茎部位的秋水仙碱从内向外呈递增趋势：外膜质层的含量为0.134%，鳞茎外层的含量为0.171%。militarine和dactylorhin A为杜鹃兰的丁二酸苄酯苷类主要成分，有延缓衰老及提高衰老动物的学习认知能力[52-54]，被作为一种分析杜鹃兰质量的指标成分。

4 小结与展望

杜鹃兰作为我国传统的中药，药用历史悠久，有抗癌、降压、抗菌等作用，在临床上常作抗癌药使用。目前对杜鹃兰的化学成分、人工栽培、药理作用等方面的报道渐多，对其发挥药效物质基础、单体化合物抗癌作用机制和复方制剂的质量标准等研究较少。因此，在今后的研究中，可对杜鹃兰药理活性进行跟踪与筛选，系统研究其化学成分，确定药效物质基础；深入研究杜鹃兰活性成分的作用机制和复方制剂质量标准，对杜鹃兰开发新药和新剂型具有重要意义。另外，杜鹃兰属我国珍稀药材，人们无节制的采摘导致资源匮乏，市场上出现命名和品种混乱使用的情况，严重影响其在临床用药的安全性，建议建立资源保护措施。