拟穴青蟹一种含CTLD结构域基因的克隆及表达分析

王 田，赵 明，张凤英，马凌波，马春艳

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

拟穴青蟹（Scylla paramamosain）隶属于甲壳纲（Crustacea），梭子蟹科（Portunidae），青蟹属，是我国重要的海水养殖蟹类，主要分布在东南沿海［1］。随着养殖规模的扩大，养殖水域的水质逐渐恶化，导致病害频发，严重制约了产业发展。提高拟穴青蟹自身免疫力能减少抗生素的使用，对于蟹苗成活率的提高及良性养殖模式的建立具有重要意义。拟穴青蟹的血液循环方式为开管式循环，因而缺乏抗体介导的免疫反应，仅具有先天性免疫［2-3］。模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）能够与病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）结合，二者的相互识别和作用是启动先天免疫应答的关键。C型凝集素（C-type lectin，CLEC）是钙离子依赖型的一类动物凝集素［4］，是拟穴青蟹重要的模式识别受体［4-5］，种类繁多，功能多样，是免疫研究的一大热点。

C型凝集素的典型特点是具有一个或多个糖识别结构域（carbohydrate recognition domain，CRD），CRD必须与钙离子结合才能发挥凝集活性［4］。研究证实C型凝集素家族中的一些蛋白已失去凝集活性，因而将CRD改为CTLD（C-type lectin-like domain）更为准确。CTLD是C型凝集素家族的功能保守区，含有110～130个氨基酸残基，其整体为内外双环结构，内环也叫长环区（long loop region，LLR），长环区参与了钙离子依赖的糖结合活性，能够识别PAMP，从而激发先天免疫反应。根据有无长环区将CTLD分为常规型和紧密型两种类型。除此之外，CTLD含有4个保守的半胱氨酸，可形成两对二硫键，以此来稳定自身结构。与脊椎动物C型凝集素的保守性相比［6］，无脊椎动物含有种类更为丰富、功能更加多样的 C型凝集素，例如，在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的基因组中检测到32个编码 CTLD的基因，在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现了至少183个 C型凝集素基因［7］，这表明无脊椎动物的C型凝集素极有可能具有不同的配体特异性。目前对于拟穴青蟹C型凝集素的研究有了较为丰富的成果，例如已证明C型凝集素表达于多种重要的免疫组织［8-9］，如肝胰腺、血淋巴、鳃等。且同一组织可产生多种不同功能的C型凝集素［8-9］。这些凝集素参与前酚氧化酶活化［10］、包膜增强［10］、血细胞结瘤、抗菌活性［11］、抗真菌活性［12］等，例如，来自烟草天蛾（Manduca sexta）幼虫的C型凝集素可刺激酚氧化酶活化或促进细胞包囊和黑化［13］。由于C型凝集素种类及功能多样，拟穴青蟹中C型凝集素的分子特征和功能还有很大的研究空间。

本文在拟穴青蟹中发现了一种含CTLD结构域的新基因，将其命名为SpCTLD，通过生物信息学方法对其cDNA全长进行分析，通过qPCR技术检测该基因在拟穴青蟹幼体不同发育时期和组织中的表达，通过人工感染副溶血弧菌来初步研究SpCTLD在拟穴青蟹抗细菌反应中是否发挥作用，旨在丰富拟穴青蟹C型凝集素的研究，对其先天免疫机制的研究起到参考作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

拟穴青蟹幼体样本取自海南琼海东海水产研究所养殖基地，根据拟穴青蟹不同发育时期的特点，可将其幼体时期分为溞状幼体 I-V（Z1-Z5）、大眼幼体（M）、仔蟹 I期（C1）和仔蟹Ⅱ期（C2）。未处理的成蟹样本购于上海市东方水产市场。副溶血弧菌胁迫实验所用成蟹样本网购于潮汕，经形态及分子鉴定，确定为拟穴青蟹。实验前将拟穴青蟹在本实验室水循环系统中提前养殖一周。所取样品均加无液氮型样品RNA保存液（生工生物工程有限公司），冻至-80℃保存，以备后续提取RNA使用。

1.2 实验方法

1.2.1SpCTLD全长的获得

本实验室通过转录组测序获得了SpCTLD的核心序列，在此基础上利用 NCBI在线软件（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primerblast／）设计特异性引物，5′-RACE的特异性引物为 5-F1：TTGCTTTCTCTGACCCTTAT，3′-RACE的特 异 性 引 物 为 3-R1：TCTAAGCCAACGAATGCAGC，另一方向引物为试剂盒自带通用引物。将RACE产物电泳检测，并割胶回收目的条带，克隆到 pMD19-T载体上，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆送至上海杰李生物公司测序，通过对所得序列进行拼接，并与本实验室数据库进行本地Blast，最终获得1 237 bp的 cDNA序列（Genebank：MN508365）。3′-RACE结果见图1。

图1 3′-RACE扩增结果Fig.1 Amplification result of 3′-RACE

1.2.2 序列的生物信息学分析

使用 NCBI在线比对工具 BLAST（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）进行比对分析。使用 ORF Finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）查找序列的开放阅读框。使用 InterPro（http：／／www.ebi.ac.uk／interpro／）分析蛋白质的同源家族、保守结构域、信号肽等。使 用 ExPASy （https：／／web. expasy. org／protparam／）分析蛋白质的分子量和等电点。使用 Target P 1.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）预测亚细胞定位，使用 Mitoprot（http：／／ihg.gsf.de／ihg／mitoprot.html）预测线粒体定位序列。

1.2.3 病原胁迫实验的样品处理

实验所用拟穴青蟹平均体质量在80 g左右，设置4组样本，分别为空白对照组、生理盐水组、灭活的副溶血弧菌组、有活性的副溶血弧菌组。前期预实验证明1×105CFU·mL-1是拟穴青蟹产生免疫响应的最佳剂量。将培养的副溶血弧菌稀释为1×105CFU·mL-1，取二分之一体积进行高温高压灭活。空白对照组不注射任何药品，其他3组分别注射生理盐水、灭活的副溶血弧菌、有活性的副溶血弧菌，每只拟穴青蟹注射量为 25μL。空白对照组取样时间为 0、3、6、9、12、24 h，其他 3组取样时间点为 3、6、9、12、24 h，每组每个取样时间点设置3个重复（3只蟹），所取组织为血淋巴（HE）、肝胰腺（HEP）、胸神经节（TG）、肌肉（MU）、鳃（GI）、心脏（H）、大触角（ATA）、小触角（ATU）、Y器（YO）、表皮（CU）、眼柄（ET），组织样品加无液氮型样品RNA保存液（生工生物工程有限公司），冻至-80℃保存，后续提取RNA并反转录。

1.2.4 实时荧光定量 PCR分析

由于18S rRNA在拟穴青蟹的多种样本中稳定表达，本文将其作为SpCTLD基因表达分析的内 参 基 因［14］，18S 引 物 序 列 为 18S-F：GGGGTTTGCAATTGTCTCCC，18S-R：GGTGTGTA CAAAGGGCAGGG。每个样本3个重复，采用标准曲线法分析SpCTLD在各个样本中的相对表达量，并对其进行生物学显著性差异分析。qPCR所用引物为 C-F：TCTGACCCTTATCGCGGCTA，CR：AAAAAGGAGGTCAGCCCCTC。所用试剂盒为北京全式金生物技术有限公司的Tip Green qPCR SuperMix试剂盒，反应体系为10μL，包含正向引物0.2μL，反向引物0.2μL，SuperMix 5μL，无核酸酶水3.6μL，cDNA模板1μL，两步法程序设为94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。

2 结果与分析

2.1 SpCTLD基因的cDNA序列分析

通过序列扩增，获得的SpCTLD基因cDNA全长为1 237 bp，其中开放阅读框为468 bp，编码155个氨基酸，此外还有82 bp的5′UTR和687 bp的3′UTR，在3′UTR区域含有典型的加尾信号AATAAA（图 2）。预测其蛋白分子量为18.32 kDa，等电点为 7.56。Target P 1.1 Server和Mitoprot预测该蛋白定位于线粒体，含有信号肽，为分泌蛋白，该预测可靠性等级为1（最高等级可信度）。线粒体靶向序列为第1到14个氨基酸（MAPSRPLVLLTVLL），切割位点为第15个氨基酸（S）。信号肽预测结果为第1到21个氨基酸，信号肽N端为第1到6个氨基酸，疏水核心区为第7到16个氨基酸，C端为第17到21个氨基酸。配体结合位点为124E、128A、130N、136K、138S、139S、140E、141Y、144D、145Y、146K。结构域CTLD位于第26到151个氨基酸。在第89到91个氨基酸出现了Ca2+特征性识别基序LND。

2.2 SpCTLD基因在拟穴青蟹幼体和组织中的表达

从溞状幼体I期到仔蟹Ⅱ期，SpCTLD在拟穴青蟹幼体各个时期均有表达（图3），并且整体表达量较高。从Z1期到Z4期整体表达量较为稳定，至Z5期达到最高点，而后至M期和C1期略有下降，C2期表达量大幅下降，远远低于其他时期，达到最低点。

qPCR检测SpCTLD在拟穴青蟹不同组织中的表达结果显示，SpCTLD在所检测的12个组织（血淋巴HE、肝胰腺HEP、眼柄ET、射精管ETU、精巢 TE、肌肉 MU、鳃GI、心脏 H、大触角ATA、小触角ATU、Y器 YO、表皮 CU）中均有表达（图4），其中在鳃中表达量最高，射精管次之，且两者的mRNA表达量远远高于其他组织。SpCTLD在肝胰腺、表皮、大触角、小触角、血淋巴、肌肉这几个组织中的表达量比较接近，远低于其在鳃和射精管的表达量。其中心脏、Y器、眼柄以及精巢的mRNA呈现显著低表达，且这几者的表达量较为接近。

2.3 病原胁迫样本中SpCTLD基因的表达分析

副溶血弧菌感染拟穴青蟹后，选取肝胰腺、血淋巴、鳃3个重要的免疫组织进行SpCTLD表达模式分析，SpCTLD的mRNA在组织中的相对表达量变化分别对应图5、图6、图7。综合来看，3个组织中的空白对照组和生理盐水组表达较为平稳，整体变化不大。在肝胰腺中，活菌组中SpCTLD的表达在9 h明显升高，到12 h达到最高。灭活菌组和活菌组的表达模式基本一致，但灭活菌组的表达量明显低于活菌组。在血淋巴中，灭活菌组在9 h表达量达到最高，活菌组在12 h达到最高。在鳃中，灭活菌组的mRAN表达量变化不显著，活菌组的表达量在12 h达到最高。

图2 SpCTLD的cDNA全长及编码的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and coding am ino acids of SpCTLD

图3 SpCTLD基因在幼体不同发育时期的表达Fig.3 Expression of SpCTLD during different larval development stages

图4 SpCTLD在不同组织中的表达Fig.4 Tissue distribution analysis of SpCTLD

图5 不同处理组样本肝胰腺中SpCTLD的表达变化Fig.5 Expression of SpCTLD in hepatopancreas sam ples from different treatment groups

图7 不同处理组样本鳃中SpCTLD的表达变化Fig.7 Exp ression of SpCTLD in gill sam p les from different treatment groups

3 讨论

本研究获得了拟穴青蟹一种C型凝集素新基因SpCTLD的cDNA全长，生物信息分析显示，SpCTLD具有C型凝集素家族的保守结构域CTLD（26-151aa），此结构主要由两个α螺旋和两个反向的β折叠组成［15］，其双环结构中的长环区参与了钙离子依赖的糖结合活性，能够通过识别PAMP从而激发先天免疫反应。CTLD超家族内部存在广泛的结构差异，具有除糖结合外的一系列其他功能。CTLD含有的Ca2+特征性识别基序有 EPN，N-乙酰氨基葡萄糖胺（GlcNAc），岩藻糖（Fuc）和葡萄糖（Glc），QPD（Gln-Pro-Asp）等，能够识别半乳糖（Gal）和 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）［16］。其中EPN基序对甘露糖的结合起重要作用，QPD基序对半乳糖的结合起重要作用。所有的脊椎动物都有一个WND基序。但在无脊椎动物中，进化导致了CTLD缺乏特征性基序WND，或者突变为其他类似基序。例如在LvLT［17］和 PsLT［11］中，WND基序被 VND取代。同样，MnCTLDcp1中的 WND被 WTD替代［18］。有研究表明，许多虾的QPD基序发生了突变。昆虫和虾的 C型凝集素或含有 FRD，或含有VND［19］，但这并不影响它们的细菌凝集活性或特异性［20］。本研究获得的拟穴青蟹SpCTLD氨基酸序列中未发现WND基序，而是存在LND基序，而LND是Ca2+特征性识别基序之一，因此符合无脊椎动物CTLD的进化特征。

一般来说，基因功能和其表达分布存在密切关系。SpCTLD在拟穴青蟹幼体不同时期都有表达且整体表达量较高，在溞状幼体Ⅴ期表达量最高，推测与溞状幼体Ⅴ期向大眼幼体变态有关，因为变态过程中青蟹抵抗力弱，易受病菌感染。仔蟹Ⅱ期表达量最低，可能是由于随着青蟹的发育，其生理机能趋于完善，适应能力与生存能力大幅提升。对SpCTLD的组织分布分析表明，在所检测的12个组织中均有表达，即SpCTLD倾向于广泛分布，这与先前的一些研究结果一致——在除了肝胰腺的其他组织中高表达的C型凝集素倾向于广泛分布［15］。甲壳动物的鳃是一种非常重要的器官，具有呼吸、排泄、渗透压调节、病害防御等功能［21］。本研究中SpCTLD在鳃中的表达量远高于其他组织，符合鳃的生物学功能特征。另外，SpCTLD在射精管中的显著高表达值得注意，提示该基因可能与青蟹的生殖相关。这与先前的研究有相似之处，段利朋等［22］从拟穴青蟹肝胰腺中克隆得到两条C型凝集素基因：Splectin3和Sp-lectin4，二者于射精管中高表达，证明其在生殖系统中发挥重要作用，因此SpCTLD在拟穴青蟹生殖系统中的具体功能需要深入研究。副溶血弧菌胁迫实验中，活菌组都在12 h达到最高，在24 h迅速下降，灭活菌组在9 h或12 h达到最高，样本处理后12 h内活菌组SpCTLD的mRNA表达量上调最为显著，说明SpCTLD可能参与了拟穴青蟹的抗副溶血弧菌反应，但对于阐明SpCTLD的具体作用机制及功能，后期还需深入研究。

综上，本研究获得了拟穴青蟹C型凝集素家族新基因SpCTLD的cDNA全长，通过副溶血弧菌胁迫实验初步证明了其参与拟穴青蟹抗细菌反应，在拟穴青蟹先天免疫过程中发挥作用，该研究结果对丰富C型凝集素在甲壳动物先天免疫反应中的研究有积极意义。