大口黑鲈北方亚种群体和“优鲈1号”群体及其正反杂交子代的遗传和生长性能比较

周家辉，李胜杰，姜 鹏，孙 雪，韩林强，白俊杰

（1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州 510380；2.上海海洋大学，上海 201306；3.佛山市三水白金水产种苗有限公司，广东佛山 528133）

大口黑鲈（Micropterus salmoides），隶属于鲈形目（Perciformes），太阳鱼科（Cehtrachidae），黑鲈属，是一种著名的游钓性鱼类，根据形态和地理分布差异大口黑鲈可分为北方亚种（M.salmoides salmoides）和佛罗里达亚种（M.salmoides floridanus）［1］。大口黑鲈具有生长快、抗病力强、起捕率高、无肌间刺、肉质鲜美等诸多优点［2］，深受养殖者和消费者喜爱，现已推广到全国各地养殖。2017年大口黑鲈国内年产量为45.7万 t［3］，是我国的主导养殖鱼类之一。樊佳佳等［4］和李胜杰等［5］通过形态学特征和分子标记的研究表明，我国养殖的大口黑鲈在分类地位上属于北方亚种。基于群体选育，中国水产科学研究院珠江水产研究所培育的大口黑鲈“优鲈1号”（GS01-004-2010）新品种生产性能优良，其推广应用在一定程度上满足了养殖业的需求，但目前苗种市场对良种的需求仍然较大［6-7］。

大口黑鲈自1983年从中国台湾引进到内地后，未再引进新的种质资源。经过多年的养殖，国内养殖的大口黑鲈群体的遗传多样性显著低于国外的野生群体［8］。因此本实验室于2010年重新从美国引进大口黑鲈北方亚种野生群体，其遗传多样性较为丰富，遗传改良潜力较大。杂交育种是获得具有优良经济性状的养殖品种的有效途径之一，能够将亲本的优良性状转移给子代［9］。本研究将大口黑鲈北方亚种引进群体和大口黑鲈“优鲈1号”进行自交和正反杂交，分析自交与正反交子代间的遗传多样性以及筛选生长优势的组合，以期为大口黑鲈优良品种的培育提供基础数据和参考资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

繁殖用的大口黑鲈“优鲈1号”和北方亚种引进群体亲鱼均来自中国水产科学研究院珠江水产研究所良种基地，北方亚种引进群体为2010年从美国引进的野生群体的第3代子代。2017年3月从两个群体中分别挑选无病无伤、平均体质量为0.65 kg的1龄鱼作为亲鱼，注射LRH-A2和DOM进行人工催产。每组繁殖所用亲本数量均为80尾，雌雄比率1∶1，在水泥池中自然产卵受精，孵化出来的鱼苗按照常规育苗方法进行培育［6］。为方便阐述，北方亚种自交群体、“优鲈1号”自交群体、正交群体［北方亚种（♀）ד优鲈1号”（♂）］、反交群体［“优鲈1号”（♀）×北方亚种（♂）］分别用N、G、NG和GN表示。生长对比实验结束后，从每个群体挑选30尾剪取部分鳍条固定于95%的乙醇中备用。

1.2 微卫星引物

实验所用的12对大口黑鲈SSR引物（表1）参考梁素娴等［10］所筛选，具有较高的遗传多态性。所有引物均由广东艾基生物技术有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取

采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取鳍条样品基因组DNA。提取的基因组DNA采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量，利用紫外分光光度计（Eppendorf公司AG2231型）检测浓度，用ddH2O稀释至50 ng·μL-1，保存于-20℃备用。

1.3.2 PCR反应条件及产物检测

PCR反应体系总体积为20μL，分别包含：10 μL 2×MasterMix（Bioteke公司）、上下游引物（10 μmol·L-1）各 2μL、模板 DNA 1μL、ddH2O 5 μL。PCR扩增反应条件：94℃预变性3 min后进入35个循环，94℃变性30 s，退火45s，72℃延伸30 s，循环结束后72℃再延伸10 min，4℃保存。产物检测委托上海捷瑞生物工程有限公司进行短串联重复序列（STR）分型分析，具体方法为：将PCR产物与特异性荧光标记（FAM、HEX或ROX）混匀，后置于ABI3730XL测序仪（美国 ABI公司）样本架上进行毛细管电泳检测，数据采集，分析每个SSR引物在不同样本中的条带数确定各样本基因型。

1.3.3 生长比较

为了比较自交与正反交子代在生长速度上的差异，在珠江水产研究所养殖基地的水泥池中进行生长对比实验。待鱼苗生长到体质量30 g左右时，从各个组中各挑选60尾规格接近的实验鱼，采用CWT对不同部位进行标记后同塘养殖，N、G、NG和GN群体注射位置顺序依次为臀部、腹部、背部和头部。实验起止时间为3月龄至12月龄（2017年8月至2018年5月），期间5、8月龄和12月龄各测量一次数据，每组测量至少30尾鱼。测量方法：使用电子天平称量体质量、数码相机拍照记录鱼苗生长状态、鱼类外部形态测量软件测量鱼体形态指标。

表2 4个大口黑鲈群体在12个微卫星位点中的遗传多样性信息Tab.2 Genetic diversity information of 4 M icropterus salmoides populations based on 12 m icrosatellite loci

1.4 数据统计及分析

根据每个个体PCR扩增条带的大小确定其基因型，运用 Popgene32（Version 1.31）软件分析各群体中每个微卫星位点的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、遗传分化指数F-统计量（Fst）以及 Nei’s遗传距离（Ds）。基于等位基因频率，运用PICCALC软件计算每个位点的多态信息含量（PIC）。采用SPSS 19.0软件中单因素方差分析比较检验组间差异，以P＜0.05作为差异显著。

生长数据分析所用公式为：

绝对增长率 （AGR）＝（W2-W1）／（d2-d1）

特定增长率 （SGR）＝100×（lnW2-lnW1）／（d2-d1）

式中，W1、W2分别为实验天数d1和d2时实验鱼的体质量。

2 结果与分析

2.1 4个不同群体的遗传多样性分析

12对SSR引物在N、G、NG和GN 4个群体所有个体中均能扩增出清晰的条带，共扩增出126个等位基因（表2）。除JZL60位点在G群体中表现为单态外，其他位点在大口黑鲈4个群体中均表现出多态性。N、G、NG和GN群体的平均等位基因数（Na）分别为 2.6、2.4、2.7和 2.8，平均有效等位基因数（Ne）分别为 2.1、2.0、2.3和2.1，平均观测杂合度（Ho）分别为 0.519、0.480、0.729和 0.664，平均期望杂合度（He）分别为0.419、0.454、0.553和 0.519，平均多态信息含量（PIC）分别为 0.407、0.412、0.454和 0.425。4个群体中，NG群体的平均有效等位数、平均观测杂合度、平均期望杂合度、平均多态信息含量均为最高，其遗传多样性最高，而G群体的遗传多样性最低。

2.2 不同群体间遗传分化和亲缘关系

大口黑鲈4个群体间的Fst统计量见表3，根据WRIGHT［13］提出的遗传分化标准，GN群体与G群体的遗传分化指数最大（0.149），达到中等分化；N群体与G群体的遗传分化指数最小（0.019），分化很弱。4个群体的标准遗传距离见表3，根据Nei’s计算群体的遗传距离，N群体和G群体之间的遗传距离最近（0.034），GN群体和G群体间的遗传距离最远（0.384）。将不同群体间的遗传距离进行UPGMA聚类（图1），结果显示，N群体和G群体首先聚为一支，然后再与NG群体聚为一支，最后与GN群体聚合。

2.3 不同群体间的生长速度比较

各取样月龄内，4个群体的体质量、体长和体高数据见表4。对不同群体间的各生长指标进行单因素方差分析，结果显示均无显著性差异（P＞0.05）。12月龄时 N、G、NG、GN群体的平均体质量分别为（388.22±72.08）、（372.50±83.51）、（400.12±89.36）、（419.91±66.82）g。在体质量和体高平均值方面，4个群体从大到小排序依次均为GN＞NG＞N＞G。生长速度比较见表5，4个群体的体质量日增长量随着月龄的增加呈现先升高后降低，整个实验期间AGR和SGR从大到小排列次序分别为GN＞NG＞N＞G和GN＞NG＞G＞N，结果显示在生长速度方面GN群体最快，其次为NG群体。

表3 大口黑鲈4个群体的遗传距离和遗传分化指数Tab.3 Nei’s genetic distance and pairw ise F st among four M icropterus salmoides populations

图1 大口黑鲈北方亚种引进群体、“优鲈1号”及其杂交子代的UPGMA聚类分析图Fig.1 UPGMA clustering using Nei’s unbiased genetic distance（1978）of four M icropterus salmoides populations

表4 各采样月龄内大口黑鲈4个群体的体质量、体长和体高的比较Tab.4 Comparation of grow th of body weight，body length and body height of four M icropterus salmoides populations

表5 各采样月龄内大口黑鲈4个群体的体质量增长率Tab.5 Grow th rate of body weight of four M icropterus salmoides populations at different periods

3 讨论

3.1 4个大口黑鲈群体的遗传多样性及遗传分化

微卫星DNA又称为短串联重复序列，作为第二代分子遗传标记技术，具有数量多、分布广和共显性等诸多优点，已成为分析生物遗传多样性和遗传差异的有效工具［14-15］。丰富的遗传多样性是培育优良性状品种的基础，而明确不同群体间的遗传距离和遗传分化水平，对亲本的选择具有指导意义［16-17］。群体的遗传多样性主要表现在等位基因数的丰富程度、遗传杂合度的大小和多态信息含量3个方面［18］。等位基因越丰富，遗传杂合度越高，多态信息含量越高，说明群体的遗传多样性越丰富。本研究利用12对微卫星DNA对4个大口黑鲈群体检测发现，无论从平均有效等位基因数还是平均期望杂合度、平均观测杂合度、平均多态信息含量，NG群体的数值均是最高，表明NG群体的遗传多样性最高，其次为GN群体，说明通过杂交方式提高了杂交子代群体的遗传多样性。G群体的遗传多样性最低，可能是由于其奠基群体数量较少，连续多代的选育和自交使得遗传多样性出现了降低［19-20］。尽管如此，根据BOTSTEIN等［21］的划分标准，大口黑鲈4个群体的多态信息含量均为中度多态（0.25＜PIC＜0.50），且两个杂交子代群体高于两个自交群体，说明杂交子代具有一定的杂种优势和良种选育潜力。

亲本间的遗传距离越大，杂交子代的杂合位点越多，杂交优势越明显［22］。检测大口黑鲈4个群体间Ds和Fst发现，N群体和G群体间的Ds和Fst均较小，其值分别为 0.034和 0.019，亲本间遗传分化较弱。大口黑鲈群体间的杂交方式不同，子代的遗传表现也不相同。4个群体的Ds和Fst显示，NG和GN群体均与N群体的遗传距离更近，表明N群体对杂交子代的贡献率大于G群体。

3.2 4个大口黑鲈群体的生长及杂种优势

杂交可以将不同群体的优良性状集中在一起，我国鱼类杂交育种取得了不少的成果［9，23-24］。根据亲缘关系的远近，鱼类的杂交可分为远缘杂交（不同科、亚科、属之间的杂交）和近缘杂交（同一物种不同品种、地理群体间的杂交）。关于大口黑鲈种间杂交的报道已有不少，但杂交子代在生长性能上是否具有优势尚无定论，例 如：WILLIAMSON 和 CARMICHAEL［25］、PHILIPP和WHITT［26］使用大口黑鲈佛罗里达亚种和北方亚种杂交，1龄时北方亚种生长速度快，杂交种次之；KLEINSASSER等［27］研究表明佛罗里达亚种♀×北方亚种♂的杂交子代比两亲本的生长速度更快。种内杂交在大口黑鲈中尚未见相关报道，但在其他鱼类和贝类中已有种内杂交优势的报道。例如：河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）不同地理群体间的杂交子代的全长增加率、质量增加率、杂交优势率均高于同一地理群体间的自繁子代［28］。张守都［29］使用海湾扇贝（Argopecten irradias）的加拿大群体和中国养殖群体进行不同地理种群间的杂交，发现杂交子代在成活率以及生长上具有显著的杂种优势；宋盛亮［30］使用长牡蛎（Crassostrea gigas）不同地理种群进行完全双列杂交，6个杂交子代群体均显示出杂种优势。本研究结果显示，大口黑鲈种内杂交无论是正交还是反交群体生长速度均快于亲本群体，表明种内杂交是提高大口黑鲈生产性能的一个有效途径。在生长性能方面GN群体优于NG群体，说明在后续的杂交育种过程中应选择生长优势更大的杂交组合方式。

综上所述，大口黑鲈北方亚种引进群体与“优鲈1号”杂交后，在一定程度上提高了杂交后代的遗传多样性。大口黑鲈4个群体中，GN群体（“优鲈1号”♀ ×北方亚种♂）的生长速度最快，表现出一定的杂交优势。本研究结果为大口黑鲈良种培育和遗传改良提供了科学依据，同时也为大口黑鲈养殖产业的健康稳定发展提供了一定的技术资料。