不同配比复合益生菌对灰海马幼苗存活、生长及免疫的影响

蔡怡山，张 东，刘 鑫，林听听，夏连军

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

灰海马（Hippocampus erectus），又称线纹海马，我国于2009年从美洲引进［1］，因其个体大、生长快、养殖密度高等优点，已成为我国目前海马养殖的主要品种。经过近10年的养殖探索，灰海马的人工繁育和养殖技术获得了很大的突破［2-6］。近年来，我国沿海地区从南到北（如海南、广东、福建、山东、河北等）不断有灰海马规模化养殖成功的报道。尽管灰海马规模化养殖取得了可喜的成效，但和其他养殖海马一样［7］，灰海马易患肠炎病，因而限制了灰海马养殖产业的发展。

海马主要使用价值在于药用，为防止药用成分受到污染或者药用价值降低，用传统抗菌药物治疗海马肠炎病害并不适合，而且生产实践也表明使用抗菌药物的治疗效果并不理想。在患病灰海马和健康灰海马肠道菌群的研究中发现，健康个体和患病个体肠道内均含有大量的弧菌属（Vibrio）细菌，但是健康个体还含有大量的乳杆菌属（Lactobacillus）细菌，而患病个体极度缺乏乳杆菌属细菌［8］。在库达海马（H.kuda）中也发现健康个体和患病个体肠道内均含大量的弧菌属细菌，但健康个体较患病个体含显著丰富的芽孢杆菌属（Bacillus）细菌［9］。这两项研究报道突显了益生菌在维持海马健康方面的作用。此外，借鉴益生菌在养殖鱼类过程中发挥作用的成功案例［10-11］，推测益生菌可能对海马肠炎具有预防甚至治疗作用。

目前水产养殖中最常见的益生菌有芽孢杆菌和乳酸菌（lactic acid bacteria）。其中，芽孢杆菌中最常用的有枯草芽孢杆菌（B.subtilis）［12］和凝结芽孢杆菌（B.coagulans）［13］。乳酸菌种类繁多，按形状可分杆菌和球菌，杆菌又分乳杆菌属和双岐杆菌属（Bifidobacterium），球菌又分链球菌属（Streptococcus）和肠球菌属（Enterococcus）。在水产养殖中最常用的乳酸菌有植物乳杆菌（L.plantarum）［14］、嗜酸乳酸菌（L.acidophilus）［15］和粪肠球菌（E.faecalis）［16-17］。这些益生菌在水产养殖中均取得了良好的效果。此外，已有不少研究表明，与单种益生菌相比，复合益生菌不仅集合了单种益生菌的功能，而且增加了协同共生作用，更适合复杂多变的生态环境［18］。SALINAS等［19-20］、ALY等［21］和夏磊等［22］分别研究发现，两种或者3种益生菌联合添加对各自养殖动物（金头鲷Sparus aurata、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus、凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei）的益生效果要明显优于单种菌。然而，复合菌以何种配比添加才能达到最优效果，国内外研究较少，这也制约了复合益生菌的应用。另外，复合菌使用效果也因种而异［20-22］。为更好地研究益生菌对海马养殖的有益效果，本研究以枯草芽孢杆菌以及乳酸菌中的植物乳杆菌和粪肠球菌为复合益生菌源，测试单菌及不同配比的复合益生菌对灰海马幼苗养殖效果的影响，以期筛选出效果最佳的复合菌配比。

1 材料与方法

1.1 实验菌粉

枯草芽孢杆菌购自南京渔丰生物科技有限公司，植物乳杆菌和粪肠球菌购自中国台湾亚芯生物科技有限公司。三者均为白色或类白色粉末，使用前按产品说明书的方法活化后，分别用乳酸菌常用培养基（MRS）和芽孢杆菌常用培养基检测活菌量，得出活菌量均≥1×1011cfu·g-1。

1.2 实验配比

本实验所设定的3种益生菌的配比及分组见表1。根据产品说明书的参考使用量，本实验每组的菌粉添加浓度为15 mg·L-1，即往400 L的水体中加入总菌粉6 g。

表1 实验处理设计Tab.1 Experim ental design

1.3 实验动物及方法

实验灰海马2018年7—10月取自福建绅蓝生物科技有限公司储备的灰海马优质亲本同一天所产的新生苗［初始体高（1.0±0.1）cm］。本实验共分10组（表1），每组3个重复，每个重复在1个装有400 L自然海水（水温28～29℃、盐度31～32）、持续充气的玻璃缸养殖桶进行。

实验开始时，将新生苗随机分配到各个养殖桶中，每桶200尾。将菌粉制备成悬浊液后，按所设定的配比向养殖桶中添加菌粉，即每桶6 g（浓度为15 mg·L-1）。之后每隔两天添菌一次。添菌前，先将养殖桶中的水排去2／3，然后补加新鲜海水至400 L。整个实验期间，除添菌当天换水外，其他时间均不换水；幼苗每天投喂足量桡足类，上午和下午各一次。实验共持续50 d。

1.4 指标测定

1.4.1 养殖水体菌群

实验结束后，采集各组的养殖水样，分析水体中的弧菌属细菌、芽孢杆菌属细菌和乳酸菌。用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂（TCBS）培养基检测弧菌总数，用 Man Rogosa Sharpe（MRS）培养基检测乳酸菌总数，用芽孢杆菌常用培养基 （葡萄糖 10.0 g· L-1、磷酸钙 5.0 g·L-1、硫酸铵 0.5 g·L-1、氯化钾 0.2 g·L-1、七水硫酸镁 0.1 g·L-1、硫酸锰 0.000 1 g·L-1、硫酸亚铁 0.000 1 g·L-1、酵母提取物 0.5 g·L-1、琼脂 20.0 g·L-1，pH 7.0±0.2）检测芽孢杆菌总数。将水样用灭菌生理盐水梯度稀释，取1×10-1、1×10-2、1×10-33个稀释度，每个稀释度100μL涂布于细菌培养基平板上，于恒温培养箱中培养，其中弧菌和芽孢杆菌28℃培养24 h，乳酸菌37℃培养48 h。培养结束后，计数各培养基平板上的菌落数，数值以每毫升水含菌落数的对数（lg N）表示。

1.4.2 存活和生长

实验结束后，清点各个养殖桶存活的幼苗数量，计算存活率。之后，每个养殖桶随机取幼苗20尾，测量体长，用于计算特定生长率（SGR）。

SGR＝100×（lnLt-lnL0）／T（1）

式（1）中，Lt和L0分别表示实验结束后和开始前各组海马的平均体长，T表示实验时间。

1.4.3 肠道免疫及菌群

体长测量结束后，每个养殖桶随机取幼苗12尾，无菌解剖取其肠道。每4尾幼苗肠道置于1个DNAse／RNAse-Free冻存管，即每个养殖桶共有3个冻存管。所有冻存管于-80℃保存。

检测时，其中1个冻存管用于分析幼苗肠道菌群，采用16S rDNA高通量测序分析技术，由上海欧易生物医学科技有限公司协助完成。另外2个冻存管用于分析幼苗肠道免疫指标。肠道组织化冻后，加入一定体积的预冷匀浆介质（Tris-HCl 0.01 mol·L-1，EDTA-Na20.1 mol·L-1，蔗糖 0.01 mol· L-1，NaCl 0.13 mol· L-1，pH 7.4），冰浴匀浆后，离心（8 000 r·min-1，15 min，4℃）取上清液用于测定肠道组织蛋白（intestinal tract protein）、免疫球蛋白 Ig M、白介素 IL-1β、干扰素IFN-α和肿瘤坏死因子TNF-α的含量。检测使用购自南京建成生物工程研究所适合鱼类检测的试剂盒，并按其说明书进行。

1.5 数据分析

实验数据均用平均值±标准差（Mean±SD）表示，存活率数据分析前经反正弦函数转换。各组之间的差异显著性用软件Origin 8.0进行单因素方差（One-way ANOVA）分析。若有显著差异，则继续进行Tukey多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 养殖水体菌群

结果发现，加菌处理组中，养殖水体均含有大量的目标益生菌，确保了实验益生菌粉能在养殖水体中活化和存活（表2）。另外，加菌处理组中，养殖水体的弧菌含量均显著低于对照组（P＜0.05）。

表2 各组养殖水体中弧菌、芽孢杆菌和乳酸菌的数量Tab.2 Number of Vibrio spp.，Bacillus spp.and lactic acid bacteria in aquaculture water（lg N cfu·m L-1）

2.2 存活和生长

不同益生菌配比对幼苗存活率影响显著（One-way ANOVA，F9，29＝23.8，P＜0.05）。其中G组和I组的值最高，其均值均超过了65%；其次是A组、B组、C组和 H组，其均值为45% ～55%；以上6组均显著高于对照组（≈40%）。存活率较低的是D组、E组和F组，其均值均低于35%，显著低于对照组（P＜0.05）；另外，这3组的死亡个体绝大部分出现在实验38～45 d这个时间段（图1）。特定生长率除了B组和E组存在显著差异外（P＜0.05），其他各组之间均无显著差异（P＞0.05）；体高均由刚出生时的1 cm左右，经过 50 d，生长至（5.45±0.53）cm，其 SGR值为3.37±0.19（图2）。

注：柱形图上的不同小写字母表示各组之间存在显著差异（P＜0.05）Note：Different lowercase letters on the histogram indicate significant differences among treatments（P＜0.05）

图2 3种益生菌（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌）不同配比处理后幼苗特定生长率Fig.2 Specific grow th rate of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

2.3 肠道免疫及菌群

不同益生菌配比对幼苗肠道Ig M含量有显著影响 （One-way ANOVA，F9，29＝26.4，P＜0.05），呈现出与存活率近乎一致的变化趋势，表现为存活率低的组别（如D组、E组和F组），其IgM含量就低；而存活率高的组别（A组、B组、C组、G组、H组和I组），对应的Ig M含量就高（图3）。而另 3个指标（IL-1β，IFN-α和 TNF-α），不同配比间差异亦显著（P＜0.05），但其变化趋势则与存活率、Ig M截然相反，表现为存活率低的组别（如D组、E组和F组）反而含显著高的IL-1β、IFN-α和 TNF-α；而剩余其他组则含量相对偏低，变化幅度较小，并且趋于稳定水平（图4～图6）。

关于肠道菌群，各组之间变化较大。聚类分析结果表明，G组＆I组、A组＆B组＆C组、D组＆E组＆F组呈现出非常相近的菌群多样性。相对丰度结果表明，在A组、B组、C组、G组、H组和I组这6组中，幼苗的肠道内含丰富的枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌（B.cereus）、植物乳杆菌和约氏乳杆菌（L.johnsonii）；而在 D组、E组和 F组则相对匮乏。另外，A组和G组含相对较高的强壮弧菌（V.fortis）（图7）。

图4 3种益生菌（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌）不同配比处理后幼苗肠道IL-1β含量Fig.4 IL-1βcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

图5 3种益生菌（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌）不同配比处理后幼苗肠道IFN-α含量Fig.5 IFN-αcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different p roportions

图6 3种益生菌（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌）不同配比处理后幼苗肠道TNF-α含量Fig.6 TNF-αcontent of Hippocampus erectus juveniles in each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions

3 讨论

作为益生菌，不管源于何地，必须在养殖动物肠道内能够定植，或者在养殖水体中能够存活，甚至繁殖，这是探讨益生菌对水产养殖动物是否具有益生效果的先决条件［23］。鉴于目前市售的大部分益生菌，其菌源主要来源于陆生动物肠道，可能不适应海水环境或者水生动物肠道，因此，非常有必要检验实验益生菌粉是否能在海马养殖水体中存活或者在海马肠道中定植。本文的水体菌群数据和肠道菌群数据表明，添加了益生菌后，水体中和海马肠道内的益生菌含量显著高于对照组，这个结果确保了实验益生菌粉能在养殖水体中存活和在肠道中定植的前提。正如其他研究中报道的一样［24-25］，添加益生菌后，水体中的弧菌显著降低，这可能归因于益生菌成了优势菌群，从而在营养和空间层面抑制了弧菌［11］。但与其他研究不同的是，本文发现益生菌组的海马肠道内的弧菌量没有明显抑制，反而部分明显增加。而其他研究均一致表明添加了益生菌后，动物肠道内的弧菌量被明显抑制［24-26］。这一截然不同的结果，可能归因于实验动物的饵料差异。其他实验动物以配合饲料为主，而海马以活饵桡足类为主［1-2］。桡足类身上携带有大量的弧菌［27-28］，因此越健康、摄食越旺盛的海马其肠道内含桡足类就越多，相应地弧菌含量就高。在先前的研究中，笔者也尝试通过抗菌药物前处理桡足类以降低其弧菌携带量，进而投喂海马来预防肠炎，结果显示，短期内投喂消毒后的桡足类，海马的生长存活表现明显改善，但长期投喂易导致病害频发，甚至较投喂未消毒桡足类的海马更甚［28］。通过肠道菌群分析，笔者发现长期投喂消毒后的桡足类致使海马肠道菌群发生很大变化，弧菌丰度虽显著降低，但其他菌，特别是益生菌，亦显著降低，菌群多样性降低［28］。所以，海马肠道内弧菌低，益生菌也低，则易发病；而弧菌高，益生菌也高，则不易发病，这一对比突显了益生菌在维持海马健康方面的作用。

图7 3种益生菌（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌）不同配比处理后各处理组幼苗肠道内菌群的分析结果（16S rDNA高通量测序）Fig.7 Intestinalm icrobiota of Hippocampus erectus juveniles at each group treated w ith probiotics（Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecalis）in different proportions（analysed by 16S rDNA sequencing analysis）

除了能抑制弧菌外，益生菌还可以提高养殖动物的免疫力，起到预防疾病的效果［8，18-22］。本文的存活率数据和肠道免疫指标数据也验证了这一效果。Ig M、IL-1β、IFN-α和 TNF-α是机体非常重要的、与发病过程息息相关的免疫指标。Ig M通常作为抗病力的指示指标，高值往往代表着高的抗病能力；而 IL-1β、IFN-α和TNF-α通常作为炎症的指示指标，高值往往代表着发炎或者感染的状态［29-31］。本文结果显示，高存活率的组别，其Ig M含量也高，这正验证了高Ig M代表高抗病能力的观点。而低存活率的组别，Ig M含量低，但 IL-1β、IFN-α和 TNF-α含量高，这也正说明了低存活率组别的幼苗抗病力低，正处于炎症状态。作为炎症状态的证据是：低存活率组别的幼苗死亡时间段集中在35～45 d，而指标检测时间点（50 d）恰位于这个时间段附近。除了提高免疫力、增加抗病力的作用外，益生菌还有一个比较公认的作用是促生长［11］；而本文未见促生长作用，其原因可能跟海马的摄食特点有关。海马贪食，即使处于非健康状态、甚至患病状态，仍然大量进食。死亡的肠炎海马中少见个体瘦瘪的海马，常见个体粗壮的海马。从存活率数据和肠道免疫数据可以发现，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌均能独自改善灰海马幼苗的养殖效果，但若将这3者混合起来使用，效果各异。复合菌有优于单菌的，如按2∶3∶1或3∶2∶1比例混合，但也有不及单菌的，如按 1∶2∶3、1∶3∶2或 2∶1∶3比例混合。这一结果表明，复合菌要想取得优于单菌的益生效果，单菌之间的配比至关重要。配比失衡，效果反而不及单菌。SALINAS等［19］研究表明，枯草芽孢杆菌和德氏乳杆菌乳酸亚种（L.delbrueckiisubsp lactis）联合添加对金头鲷的免疫提升效果要优于单菌添加。潘雷等［32］研究也表明，枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和异形双歧杆菌（B.inopinatum）联合添加对大菱鲆（Scophthalmusmaximus）的肠道弧菌抑制效果要优于单菌添加。以上两篇报道所设定的混合比例只有1∶1一组。在多配比报道中，夏磊等［22］比较了鲍鱼希瓦氏菌（Shewanell haliotis）、蜡样芽孢杆菌和双壳气单胞菌（Aeromonas bivalvium）这3个益生菌9种复合比例对凡纳滨对虾生长、免疫及抗氨氮的效果，结果发现各比例效果各异，其中6∶1∶3促生长效果最好，4∶3∶1抗氨氮效果最佳。类似地，王姝等［33］则比较了沼泽红假单胞菌（Rhodopseudpmonas palustris）和枯草芽孢杆菌4种复合比例对池塘水质的改善效果，结果发现4∶1的比例最好。

从本文9个配比中发现，枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和粪肠球菌按2∶3∶1或3∶2∶1比例配搭时，效果最佳。从这两个配比中可以推出，复合菌的益生效果可能是枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌起着主导作用，而粪肠球菌起辅助作用。粪肠球菌的比例一高，可能会抑制枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌，或者产生拮抗作用。菌菌之间相互竞争而彼此不能繁殖；或者某菌繁殖，而另两菌死亡败坏，从而导致水体耗氧、亚氮增加，进而危及养殖动物［19］。