底物大小对牡蛎幼虫附着的诱导效应

范瑞良，李楠楠，王桃妮，2，孙兆跃，2，修玉娜，2，全为民

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

牡蛎是一类具有群聚性的双壳类软体动物［1］，广泛分布于温带河口和滨海区，如长牡蛎（Crassostrea gigas）分布于中国北方沿岸，熊本牡蛎（C.sikamea）主要在江苏以南沿海［2］，能大量聚集生长形成牡蛎礁（oyster reef）。牡蛎礁具有净化水体［3］、维持生物多样性［4］、提供鱼类栖息地［5-8］、能量耦合［9］、防止海岸线侵蚀［10］和碳汇［11］等生态功能。由于过度捕捞、环境污染和病害浸染等，过去100多年来全球牡蛎礁分布面积约下降85%［12-13］。此后，为恢复牡蛎礁生境及其提供的生态服务价值，美国、澳大利亚和中国等地陆续成功开展了许多牡蛎礁恢复项目［6，8，10，14-15］。牡蛎的生长需要硬质的附着基，因此建造适合于牡蛎幼虫附着的栖息生境（礁体）是牡蛎礁恢复的重点。国内外牡蛎礁恢复项目中最常用的底物材料是牡蛎壳，但由于其数量不足，筛选适合于牡蛎幼虫附着生长的替代底物成为牡蛎礁恢复中迫切需要解决的关键技术之一［10］。

附着底物的物理和化学性质显著影响海洋无脊椎动物幼虫的附着和生长发育［16-17］，其中底物大小的影响颇受关注。如FUCHS等［18］的野外实验发现：美洲牡蛎（C.virginica）幼虫更喜欢附着于长度较短的底物上。JEFERY［19］于野外实验中发现：藤壶（Balanus）幼虫单位附着量随着底物变大依次减少（直径：6 cm＜3 cm＜1.5 cm）。LILLIS等［20］发现：鹅卵石大小对美洲龙虾（Homarus americanus）幼虫的附着无显著影响。实践表明，底物大小对海洋无脊椎动物幼虫附着的影响不一。然而，有关底物大小对牡蛎幼虫附着的影响鲜有报道。

熊本牡蛎虽然在我国有自然分布，但目前还没有规模化人工养殖［21］。因此，室内实验动物为长牡蛎，室外实验动物是熊本牡蛎。基于以往的研究结果和野外观察，本研究提出如下假设：在低牡蛎幼虫补充下，牡蛎幼虫附着密度与其底物大小呈现正相关，即随着底物变大，稚贝附着密度逐步增加。据此，本研究通过设计室内实验和野外实验比较3种规格实验底物（A：5 cm长×5 cm宽×3 cm厚、B：10 cm长 ×10 cm宽 ×3 cm厚、C：15 cm长×15 cm宽×3 cm厚，以下分别简称A、B、C）上牡蛎稚贝附着量，以期确认室内和野外自然条件下底物大小、两种实验环境及他们之间的交互作用对牡蛎幼虫的诱导效果。研究结果将对牡蛎礁修复中替代底物大小的筛选和牡蛎养殖均具有重要的理论和现实意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

室内实验于2016年5月7日至2016年6月23日在山东省莱州市国燕水产育苗场（山东莱州虎头崖镇西原村）内完成。实验生物为长牡蛎的幼虫，自受精卵开始培育20 d左右至具足面盘幼虫（pediveliger）阶段时，将实验底物置于附苗池中开展附着实验。

野外实验于2018年7月19日至2018年8月19日在浙江省宁波市奉化区莼湖象山港牡蛎养殖区内完成，实验生物为处于具足面盘阶段的熊本牡蛎幼虫。在幼虫附着高峰期（每年7月20日左右）将底物吊挂于潮间带筏架上开展野外附着实验。

1.2 实验设计

室内和野外实验均采用单因子随机区组设计，实验均设定3个底物大小处理组，各个底物大小处理组之间互为对照。每个底物大小处理组设置10个重复，室内和野外实验分别总计3个处理组合和30个实验底物。

实验底物为河沙和水泥按比例混合制作的混凝土模块（表1）。每种原料经粉碎后过80目网筛备用。

1.3 实验方法

室内实验：在育苗车间准备一个低幼虫丰度（1～2个·mL-1）附苗池，其上架设6根竹竿，随机选取10个实验底物吊挂于竹杆上，使实验底物位于水面下50 cm处，相邻实验底物相距15 cm，相邻竹杆间相距20 cm。实验期间，将沙滤后加热与未加热海水混合，保持实验池中的水温维持在24℃左右（范围为23.2～24.6℃）、海水盐度范围为26.5～27.2，每天于 1∶00、5∶00、9∶00、13∶00、17∶00、21∶00各投饵 1次，投饵量由育苗场管理人员根据幼虫生长状况而定，饵料为金藻，每天于7∶00和19∶00各换水1次，换水量为附苗池总容量的1／2，每天光照时间约为8 h，光照强度为100 lx左右，幼虫附着期间充气培养等条件均与育苗车间保持一致。

3 d后，将两个附苗池中的实验底物移置养殖池暂养，直至附着稚贝清晰可见为止（约1个月），用单反相机对每个实验底物表面进行拍照，在电脑上计数，随机选取20个附着稚贝，用Photoshop7.0测量壳高。自牡蛎受精卵至实验结束共持续48 d左右，实验期间，每天不定期观察幼虫生长状况。

野外实验：在熊本牡蛎幼虫处于具足面盘幼虫时，于2018年7月19日将底物吊挂在搭建的竹竿筏架上，底物位于筏架下50 cm处，其随涨落潮的露干、淹没和饵料等情况与野生牡蛎一致，期间不定期观察附着情况，待附着稚贝清晰可见为止（约1个月）。在此期间，实验海域白天海水温度范围为29.9～30.2℃，盐度范围为为23.7～25.7。

表1 实验基质组成成分及大小Tab.1 Chem ical com position and sizes of the experimental substrates

考虑到实验结果的一致性，仅统计实验底物正面附着稚贝的密度和壳高来显示牡蛎幼虫的附着效果。

1.4 数据处理

将每块实验底物上附着的稚贝数量换算成稚贝的密度，统计每种实验底物上附着牡蛎稚贝的平均密度（个·cm-2）和平均壳高（mm）。实验数据经过以10为底的对数函数处理后，用SPSS 19.0中的 Kolmogorov-Smirnov（以下简称 K-S）正态检验对数据进行正态性检验（P＞0.05，表2），符合正态分布。处理后数据采用SPSS 19.0统计软件进行方差分析，使用LSD法进行后检验，P＜0.05时差异显著，P＜0.01时差异极其显著；室内和野外实验中分别从3个处理组中随机选取10个密度值及与其对应的壳高，总计30组数据，使用Excel 2013绘制密度与壳高的相关性分析图，并采用SPSS 19.0中的Pearson进行相关性分析；采用Sigmaplot10.0软件绘制折线图。

表2 K-S正态检验结果Tab.2 K-S results of normal test

2 结果与分析

2.1 底物大小对附着稚贝密度的影响

单因子方差分析结果表明：无论室内实验还是野外实验，底物大小对附着稚贝密度的影响均极其显著（表3，P＝0.000）。

底物大小对附着稚贝密度的影响结果如图1所示。室内和野外实验中，A、B、C 3个处理组间差异极其显著（图1，P＜0.01），3个处理组实验底物上的附着稚贝密度高低顺序为：C＞B＞A。室内实验附着稚贝的平均密度分别为A组1.06个·cm-2，B组 5.60个·cm-2，C组 12.01个·cm-2；野外实验附着稚贝的平均密度分别为2.41个·cm-2，B组 4.65个·cm-2，C组 6.90个·cm-2。

图1 室内实验和野外实验中3种实验底物上牡蛎稚贝密度的比较Fig.1 Com parison of oyster spat density on three substrates in laboratory and field experiments（n＝10）

2.2 底物大小对附着稚贝壳高的影响

单因子方差分析结果表明：无论室内还是野外实验，实验底物大小对附着稚贝壳高的影响都极其显著（表4，P＝0.000）；

表3 底物大小对附着稚贝密度影响的单因素方差分析结果Tab.3 One-way ANOVA results of the effect of substrate sizes on settled oyster spat density

底物大小对附着稚贝壳高的影响结果如图2所示，室内和野外实验中，3个实验底物处理组间差异极其显著（图2，P＜0.01），附着稚贝壳高大小顺序为：A＞B＞C。室内实验附着稚贝的平均壳高分别为A组14.10 mm，B组8.69 mm，C组4.44 mm；野外实验附着稚贝的壳高分别为A组17.83 mm，B组 11.61 mm，C组7.43 mm。

2.3 室内和野外实验附着结果的比较

双因子方差分析结果表明（表5，表6）：2因子交互作用对附着稚贝密度影响显著（P＜0.05），对壳高影响不显著（P＞0.05）；室内和野外的实验环境对附着稚贝密度影响不显著（P＞0.05），对壳高影响显著（P＜0.05），且野外实验壳高显著大于室内实验的（P＝0.000）。

2.4 牡蛎稚贝密度与壳高之间的相关性

Pearson相关性分析结果表明：室内实验和野外实验中牡蛎稚贝密度与壳高相关性很强，且为负相关。其中，室内实验为极强相关性（表7，r＝-0.840）；野外实验为强相关性 （表 7，r＝-0.726）。

图2 室内实验和野外实验3种实验底物上牡蛎稚贝壳高的比较Fig.2 Com parison of settled oyster spat shell height on three substrates in laboratory and field experiments

表4 底物大小对附着稚贝壳高影响的单因素方差分析结果Tab.4 One-way ANOVA results of the effect of substrate sizes on the shell height of settled oyster spat

表5 室内和野外实验稚贝附着密度的双因子方差分析结果Tab.5 Two-way ANOVA results of settled oyster spat density in laboratory and field experim ents

表6 室内和野外实验稚贝附着壳高的双因子方差分析结果Tab.6 Two-way ANOVA results of settled shell height of oyster spat in laboratory and field experiments

图3 室内（a）和野外（b）实验中牡蛎稚贝密度与壳高的相关性分析图Fig.3 Analysis of the correlation between shell height and density of oyster spat in laboratory（a）and field experiments（b）

表7 室内实验和野外实验中密度与壳高的Pearson相关性分析Tab.7 Pearson correlation analysis of density and shell height in laboratory and field experiments

3 讨论

3.1 底物大小对附着稚贝密度的影响

本研究结果表明，底物大小显著影响牡蛎稚贝附着密度，即底物越大，稚贝附着密度越高。主要机制是底物越大，幼虫接触机会越大，一旦有幼虫附着，就会释放化学物质诱导其他的幼虫同伴来此聚集附着［23-24］。如王国栋等［24］发现具有更多附着面积的多层结构附着底物对菲律宾蛤仔 （Ruditapes philippinarum）、青蛤 （Cyclina sinensis）和硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）的附苗效果显著高于细砂的结果解释了这种可能。LILLIS等［19］研究发现鹅卵石大小对美洲龙虾幼虫附着的影响不显著。ADAMIAK-BURD等［25］发现水蛭幼虫更易附着于尺寸较小的底物上。这可能是由于物种间的差异。欧微龙等［26］的研究表明2种规格的底物大小对叶片山海绵的附着量差异不显著，其可能是2种底物的有效附着面积均能够满足叶片山海绵的生长，为本研究的设计思路提供了方向，并为本实验结果提供了解释的空间。FUCHS等［17］野外研究发现在长度较短的底物上美洲牡蛎稚贝附着量较多，与本实验研究结果不同。可能是由于实验海区的幼虫丰度远少于室内养殖的。大多数牡蛎幼虫会附着在邻近的优势底物上，大底物虽然增加了幼虫接触的可能性，但降低了底物上的单位稚贝附着量。室内实验A处理组的附着稚贝密度低于野外实验可能是由于室内实验暂养时海水中没有幼虫，而野外实验中一直有幼虫再次附着到底物上。本研究的结果是基于低幼虫密度的环境，如果幼虫密度高时，这种底物大小对幼虫附着的诱导效应会显著降低。

3.2 附着稚贝壳高和密度的相关性

附着稚贝壳高与密度呈负相关。很多研究与本实验结果类似，如杜美荣［27］研究发现底栖硅藻处理组附着底物上栉孔扇贝（Chlamys farreri）稚贝附着量明显多于常规方法处理组，稚贝壳高结果却与附着量相反。陈璐等［28］研究发现密鳞牡蛎（Ostrea enselamellosa）幼虫高丰度 （3个·mL-1和4个·mL-1）处理组底物上稚贝的附着效果优于低丰度处理组（1个·mL-1和2个·mL-1），生长速度却明显慢于低丰度处理组。因为随着稚贝附着密度的增大，食物、空间竞争压力增大，导致个体生长发育缓慢。野外实验中附着稚贝密度低于其在室内实验的密度、壳高却高于室内实验也可能是这个原因导致的。后期幼虫附着密度等外界条件可能会造成壳高的差异，所以，底物大小与后期壳高之间直接相关性不大。密度是牡蛎稚贝生长的关键因素之一，贝壳生长还与盐度、温度等环境条件密切相关，如王涛等［29］的盐度实验结果显示，盐度15、20和25组中熊本牡蛎稚贝壳高显著高于盐度35和40组；温度实验结果显示，稚贝壳高在温度28℃组显著高于温度16℃、20℃、24℃和32℃组。饶科等［30］研究发现，当 pH为 8.1～7.0时，近江牡蛎（C.ariakensis）的钙化率随着pH的下降而显著下降。

3.3 室内和野外实验结果的比较

通过室内和野外实验的对比，我们发现实验环境对附着稚贝密度影响不显著，而其与底物大小的交互作用对密度影响显著，可能是由于牡蛎幼虫对附着底物的选择性优于环境条件的差异。实验环境对附着稚贝壳高影响显著，这个可能有两种原因，一种是幼虫丰度的不同，导致附着密度的不同，从而影响稚贝壳高［28］；另一种是野外实验的环境更适宜牡蛎的生长。两种因子的交互作用对壳高影响不显著，可能是环境条件差异对壳高的影响大于底物大小（或稚贝密度）对其的影响。

3.4 小结

本研究表明，在低幼虫密度下，底物大小与牡蛎稚贝附着密度呈现显著的正相关。因此，在牡蛎礁生态修复中，底物大小是必须特别考虑的因子之一，选择适合规格的底物可显著提高礁体上牡蛎幼虫附着量，从而影响牡蛎礁生态修复的效果。

本实验仅证明底物大小对牡蛎幼虫附着影响显著，并未验证幼虫附着的最适底物规格，仍需下一步进行研究。

致谢：感谢育苗场工作人员在实验期间提供的帮助，杨杰青等在论文写作中给予的指导。