虾苗场3种重要病原同步定量PCR 检测技术的建立

李楠英，房文红，王 元，马清扬，李新苍，赵 姝，符贵红，周俊芳

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

引进品种凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）因为生长速度快、适应性强，其种苗培育和养殖产业在我国得到持续发展，成为我国重要水产养殖经济品种。然而，随着混养与集约化等多种模式的开发和国内外虾类产品与苗种流通的增加，我国凡纳滨对虾病原种类呈现增多趋势，如白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）、偷死病野田村病毒（covert mortality nodavirus，CMNV）、桃拉综合征 病 毒 （Taura syndrome virus，TSV）、黄头病毒（yellow head virus，YHV）、传染性肌肉坏死病毒（infectious myonecrosis virus，IMNV）和最近发生的虾虹彩病毒（decapod iridescent virus 1，DIV1）等病毒性病原［1-2］、虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）等寄生虫性病原［3］，以及副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈维弧菌（V.harveyi）和气单胞菌（Aeromonassp.）等细菌性病原［4-7］。其中，WSSV、IHHNV、TSV、YHV、IMNV所致疾病被农业部动物疫病名录（2013）列为二类疫病；尽管EHP、DIV1和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（V.parahaemolyticusAHPND，VpAHPND）为近几年新发的病原，但是这几种病原对对虾养殖造成的经济损失却非常严重，已经成为虾类养殖业的重要威胁［8-11］。鉴于对虾病原种类的多样性、危害严重性以及许多养殖病害的暴发源于病原对种苗的微量感染等，近年来生物安保育苗技术在大型对虾育苗场逐步推广［12］，部分病原的发病率和暴发程度得到明显控制，如TSV和IHHNV的检出率大幅降低，WSSV也从20世纪末的一类疫病降为二类疫病。笔者近几年在上海、海南和福建等省市的几家大型凡纳滨对虾育苗场对常见病原的检测结果表明，EHP、WSSV和DIV1为育苗场内的主要生物性危害因素，因此，这3种病原为凡纳滨对虾育苗场内构建生物安保体系的重点监控病原。

由于苗种携带病原呈微量、隐性的感染特征，因此，其检测方法首选样品用量低、灵敏度高的分子生物学技术，如常规、套式和定量PCR等检测技术。其中，定量PCR技术由于比普通PCR技术灵敏度更高且能够确定病原感染程度，因此，越来越多地被应用于重要病原的检测［13-14］。与此同时，为了适应大量样品和多种病原的检测需求，PCR检测技术也在向高通量方向发展，比如多重和同步检测技术［15-17］。然而，到目前为止还没有见到同步检测EHP、WSSV和DIV1的定量PCR技术的报道，因此，本研究的目标是建立同步检测EHP、WSSV和DIV1的定量PCR技术，以期在提高病原检测通量的同时，提高对种苗隐性感染病原的检测灵敏度和对种苗风险评估的精确度，为苗场生物安保体系的构建和对虾健康养殖提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 虾和病原

EHP、WSSV和DIV1阳性对虾样品为本实验室在上海、浙江等地养殖场采集的、经PCR分别鉴定的养殖对虾，保存于-80℃冰箱；维氏气单胞菌（A.veronii）、副溶血弧菌、哈维弧菌等病原为本实验室保存；SPF虾苗采自上海彰显渔业合作社，为阴性对照样品。

1.2 引物

分别设计靶向 DIV1 MCP基因（GenBank：MF599468）、EHP SWP 基 因 （GenBank：KX258197）和 WSSV 基 因 组 （GenBank：AF332093.3）的多对引物，送上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA提取

由于苗场虾苗个体很小，可根据培育的不同时期采集一定数量的完整个体（约20 mg）匀浆，然后参考海洋动物基因组DNA提取试剂盒说明书（天根）提取样品总DNA。

1.4 实时定量PCR质粒标准品的制备

以DIV1、EHP和WSSV阳性样品的总DNA为模板，参考文献［18］的方法和试剂，分别用合成的3种病原的定量PCR引物进行普通PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳纯化后连接pMDTM19-T载体，转化感受态细胞DH5α。提取的阳性质粒DNA按10倍比稀释成不同梯度的质粒标准品，置于-20℃冰箱保存备用。

1.5 同步扩增定量PCR反应体系和条件的确定及方法建立

首先，参考文献［18］的方法和试剂，确定一种病原（DIV1）的SYBR Green I实时定量PCR扩增的最佳引物、反应体系和程序。然后，基于DIV1的反应体系和程序，用EHP和WSSV的系列候选引物对各自的质粒标准品进行定量扩增，根据检测灵敏度、病原特异性和熔解曲线等筛选出各自的最佳扩增引物。最后，通过进一步验证和优化，建立基于SYBR Green I的3种病原同步定量PCR检测技术。

2 结果与分析

2.1 同步扩增3种病原的实时定量PCR条件与体系的确定

首先，通过对DIV1引物的筛选，确定了其最佳扩增引物（表1）、反应体系和条件：扩增体系（20μL）包含 2×TB Green Premix ExTaqⅡ（Takara）10μL，引物 IVQF（10μM）0.6μL，引物 IVQR（10μM）0.6μL，DNA模板 2μL，无DNA酶水6.8μL。最后添加ROX Reference Dye 0.4μL；扩增条件为95℃ 30 s；然后，95℃ 5 s，60℃ 20 s，循环40次［19］。最后，将以上 DIV1定量PCR方法的体系和条件设定为3种病原同步定量PCR扩增的体系和条件。

2.2 同步扩增条件下，EHP和WSSV最优实时定量PCR检测方法的建立

为了达到同步、高效扩增3种病原的目的，基于 DIV1的扩增体系和条件，运用 EHP和WSSV的系列备选引物对各自的质粒标准品进行扩增。通过对各自方法的灵敏度、特异性以及稳定性和熔解峰等筛选分析后，确定了 EHP和WSSV的最佳定量PCR引物（表1），建立了同步扩增条件下两者的最优定量PCR检测方法。如图1～图2和表2～表3所示，两种方法的相关系数（R2）均大于 0.99。其中，EHP的标曲方程和相关系数（R2）分别为y＝-3.381 5x+37.718和0.997，WSSV的标曲方程和相关系数（R2）分别为y＝-3.112 9x+35.626和0.999。

将以上系列标准品分别置于-80℃冰箱保存60 d后，各自重复检测的结果差异均不显著（P＞0.05）。

2.3 同步扩增DIV1、EHP和WSSV的实时定量PCR检测技术的验证

运用本研究建立的3种病原同步定量PCR检测技术，对经套式PCR方法检测过的15份样品（部分样品为1～3种病原阳性）进行同步扩增，并以无DNA酶水作对照，熔解曲线分析结果如图3所示。在同一块定量PCR板上，熔解曲线只在78.4℃、79.7℃、83.5℃处出现3个尖锐峰，分别与DIV1、EHP和WSSV定量扩增产物的Tm值一致，而阴性样品和阴性对照没有出现熔解峰。检测结果如表4所示，15份样品中包含8份DIV1阳性样品、6份EHP阳性样品和2份WSSV阳性样品，检出病原最低基因拷贝数分别为34 copy·μL-1（DIV1）、20 copy·μL-1（EHP）和 68 copy·μL-1（WSSV），而原先 nPCR的检测阳性数分别为 6份（DIV1）、4份（EHP）和 1份（WSSV）。

表1 同步扩增DIV1、EHP和WSSV的定量PCR引物Tab.1 Primers for simultaneous detection of DIV1，EHP and WSSV

表2 EHP实时定量PCR技术的组内重复性Tab.2 Intragroup variabilities of SYBR GreenⅠ qPCR for EHP plasm id DNA dilutions

图1 EHP SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测技术的建立Fig.1 Development of SYBR GreenⅠ-based qPCR assay for EHP

图2 WSSV SYBR Green I实时定量PCR检测技术的建立Fig.2 Development of SYBR GreenⅠ-based qPCR assay for WSSV

表3 WSSV实时定量PCR技术的组内重复性Tab.3 Intragroup variabilities of SYBR Green qPCR for WSSV p lasm id DNA dilutions

图3 同步定量PCR检测技术扩增对虾DNA的产物熔解曲线图Fig.3 M elting curves of products am p lified from shrim p DNA by synchronous SYBR G reen qPCR assay

表4 同步定量PCR和套式PCR对对虾样品中3种病原的检测结果对比Tab.4 Comparison of detection results of three pathogens in L.vannamei sam p les by synchronous qPCR and nPCR assay

3 讨论

白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫和虾虹彩病毒自发生以来先后对我国养殖凡纳滨对虾造成了重大经济损失［9，20-21］。研究表明，对虾常常被两种以上的病原同时感染，即对虾病原存在共感染甚至协同致病现象。JOSEPH等［22］在斑节对虾（Penaeus monodon）育苗场内调查发现，104份虾苗样品中，WSSV、斑节对虾杆状病毒（Penaeus monodonbaculovirus，MBV）和肝胰腺细小病毒（hepatopancreatic parvovirus，HPV）共感染（双病原或3病原共感染）率占被检虾苗总数的60.6%；胡文娟等［23］对对虾病毒的调查中也发现，WSSV与IHHNV在我国养殖的凡纳滨对虾中存在共感染现象。本研究中对虾样品的验证结果也表明，当前养殖对虾体内存在两种病原（EHP与WSSV或EHP与DIV1）甚至3种病原（EHP、DIV1和WSSV）共感染的现象。多个研究表明，建立同步或多重定量PCR检测技术可以让对虾病原的共感染现象和相对感染程度得到更清晰的揭示：SIBONGA等［24］通过建立多重PCR技术，发现斑节对虾育苗场内同时存在WSSV、MBV和IHHNV；刘飞等［25］则建立了可同时检测6种对虾病毒［WSSV、IHHNV、HPV、TSV、IMNV和对虾杆状病毒（BP）］的多重PCR检测方法，大幅提高了病原检测效率。但是，由于普通PCR方法需要对扩增产物进行电泳等后续处理，而且其检测灵敏度比定量PCR要低很多，因此，多重或同步qPCR技术更加符合高通量、快速出报告的苗场生物安保监测要求；而且，qPCR技术还可以对病原的感染程度进行准确评估。LEAL等［16］和XIE等［26］通过建立同时检测WSSV、IHHNV的双重qPCR技术和同时检测 WSSV、IHHNV与TSV的三重（RT-）qPCR技术，不仅鉴别了对虾样品中共感染的病原，而且对每种病原的感染程度进行了定量分析。

由于寡核苷酸的添加会影响qPCR的扩增效率，因此，多重qPCR检测灵敏度比单病原qPCR技术要低［16］。如果检测对象为体质量较大的养殖对虾，这种细小差异对于疾病诊断和病害防控策略的影响相对较小，但是对于体质量很轻且病原含量很低的虾苗而言，采用同步qPCR检测方法也许更为合适。本研究的质粒扩增结果表明，当总DNA中靶基因含量低至10 copy·μL-1时，本研究建立的3病原同步定量PCR检测技术对每种病原均能保持良好的组内和组间重复性，其中，WSSV在基因拷贝数为1 copy·μL-1时仍然保持较好的组内和组间重复性。对经套式PCR鉴定过的对虾样品的验证结果也显示，15份样品DNA中3种病原的最低基因含量分别为34 copy·μL-1（DIV1）、20 copy·μL-1（EHP）和 68 copy·μL-1（WSSV），这些病原的基因含量均低于nPCR对同一样品的检测限，因此，同步定量PCR检测阳性数显著多于nPCR。值得一提的是，本研究建立的WSSV定量PCR检测技术，在WSSV含量为 2 copy·reaction-1（即 1 copy·μL-1）时对应的平均CT值仍然小于36，而已经报道的、同样基于SYBR Green I染料法的WSSV定量PCR检测方法，在WSSV基因含量为11.85 copy·reaction-1时，其CT值已经大于36［27］。以上分析表明，本研究所建立的同步定量PCR技术不仅稳定，而且具有较高的检测灵敏度。对熔解曲线进行分析还可以看出，在同一块定量PCR板上对3种病原进行同步扩增后，扩增产物熔解曲线只在 78.4℃、79.7℃、83.5℃处出现3个尖锐峰，恰好对应DIV1、EHP和WSSV的产物Tm值，而阴性样品和阴性对照均没有出现熔解峰。事实上，该同步qPCR检测技术已经多次被用于养殖凡纳滨对虾样品的检测，包括对部分养殖示范合作社内养殖虾类病原的长期跟踪检测，并多次检出了目的病原，其熔解曲线始终未见到异常扩增的情况（结果未显示），表明此同步qPCR方法具有良好的病原特异性，在复杂样品中只扩增目标病原基因序列［28］。除此之外，由于感染对虾的微孢子虫种类较多，因此，本研究选择编码EHP的SWP基因为靶标［29］，也在一定程度上提高了该同步定量PCR技术的病原特异性。

综上，本研究建立的3种病原同步定量PCR检测技术，可以充分发挥定量PCR技术96孔板、384孔板的高通量优势，尤其是当单份样品中个体数量较少时，可实现多病原同板扩增，不仅能大幅缩短检测时间，提高苗场病原监测的时效性，而且可以快速揭示病原的共感染或协同现象。