EXAKT硬组织切磨技术在含有植入物组织切片中的应用

(1 山东大学口腔医学院山东省口腔组织再生重点实验室，山东 济南 250012； 2 山东大学齐鲁医院口腔科；3 山东大学齐鲁医院心血管重构与功能研究重点实验室； 4 徐州医科大学附属医院骨科)

组织形态研究中常常涉及含有各类植入物的软硬组织，例如含有钛合金种植钉或者骨粉的颌骨、股骨组织，含有荧光素标记的骨组织，以及含有金属支架的血管肌肉组织等，该类组织因其植入物的特殊性，无法按照常规的石蜡切片流程将其制成组织切片。常规的石蜡切片在处理该类组织时具有以下弊端：①无法切割金属种植体；②采用脱钙技术以降低组织的硬度[1-3]，脱钙会引起骨组织皱缩，从而导致骨组织与植入物分离；③荧光标记的组织内荧光标记物与新骨钙盐螯合，脱钙技术会导致荧光标记物流失[4-6]，严重影响结果分析[7]。因此普通的石蜡切片已经无法满足实际需求。以EXAKT硬组织切磨系统为代表的软硬组织切磨技术则可以解决这一问题[8]。本研究拟将不能用常规方法制备的含有不同植入物的组织，应用EXAKT硬组织切磨技术进行制作后，观察是否能够保持组织本身及植入物与组织之间的原有组织形态，从而评价该技术对含有不同植入物组织类型的应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1实验材料 含有钛合金螺纹种植钉的比格犬下颌骨组织(A组织)、含有钛合金直钉的小鼠股骨组织(B组织)、含有钛合金螺纹种植钉的小鼠股骨组织(C组织)、含有多孔钛材料的兔股骨踝骨组织(D组织)、含有钴铬合金支架的兔心血管组织(E组织)、含有钙黄绿素和茜素络合复合物标记的大鼠上腭组织(F组织)。

1.1.2主要仪器 EXAKT 300CP/400CS/AW硬组织切磨系统购自德国EXAKT公司，该系统包括组织切片机、组织磨片机、载片真空吸附装置、光固化包埋机、组织脱水浸润仪、数显千分尺等。

1.2 研究方法

1.2.1组织固定 将上述6种新鲜组织标本置于40 g/L的多聚甲醛固定液中，于低温(4 ℃)下固定24～48 h，具体固定时间视组织切块大小调节，固定结束后流水冲洗24 h。

1.2.2组织脱水、浸润与包埋 将组织块置于体积分数0.50、0.70、0.95、0.95、1.00、1.00乙醇溶液中并逐级上行脱水，每级脱水12 h；脱水结束后将组织逐级浸入体积分数0.50、0.30的无水乙醇光固化树脂(Technovit 7200VCL)中，每级浸润时间3～5 d，最后浸入纯光固化树脂Ⅰ以及Ⅱ中，每级浸润时间5～7 d。将经过充分浸润的组织置于尺寸合适的包埋模内，倒入光固化树脂，将包埋模放在光固化包埋机内进行聚合。先使用低强度光源照射，使包埋剂聚合约4 h；再使用高强度的蓝光照射使渗透到组织内的包埋剂完全固化，聚合时间视组织块的大小和厚度而定，约4～10 h。

1.2.3粘接载片 切割组织块获得目的切面，在下载片上滴粘合剂(Technovit 7210VLC)将组织块的非切割面与下载片粘合，光固化10 min。将组织块吸附在切片机夹具上，通过金刚锯条切割获得目的切面。将组织块吸附于磨片机对目的切面进行打磨抛光。用真空精密吸附压机将平行载片粘接到抛光后组织面上，粘合剂为Technovit 7210VLC，粘合剂要适量，不要产生气泡，光固化10 min。

1.2.4制作实验组织的切磨片 将组织块粘合有实验组织的下载片吸附于切片机的夹具上，调节夹具位置，从上载片一侧切割得到厚约200 μm的切片。将切割得到的厚片吸附于磨片机上，用各级砂砾的砂纸对切片进行打磨，得到预期厚度，最后用细砂纸对切片进行抛光。

1.2.5实验组织切片染色 A和B组织切片先进行Ladewig染色，铁苏木素AB液1∶1混合后，染色5 min(现用现配)，流水冲洗5 min, Ladewig混合液染色5 min，流水冲洗至合适的颜色，自然干燥后中性树胶封片，光学显微镜下观察。C、D、E组织切片进行苏木精-伊红染色，滴加苏木精于切片表面，染色5 min，流水冲洗多余染液后将切片置于体积分数0.01盐酸乙醇中分化30 s，流水冲洗后浸入伊红复染3 min，再流水冲洗多余染料后自然干燥，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.2.6F组织行荧光素标记并荧光显微镜观察 将F组织切片置于载物台，分别选择蓝光和绿光激发，观察钙黄绿素和茜素络合物发光效果并拍照，利用组合通道将图片进行叠加。

2 结 果

2.1 A、B组织切片Ladewig染色结果

A、B组织Ladewig染色后边缘软组织呈黄色，骨组织呈蓝色。A组织切片在光学显微镜下观察显示种植体(黑色)与骨组织(蓝色)结合紧密，螺纹附近均为新生骨(红色箭头处)，染色较均匀(图1a)。B组织切片在光学显微镜下观察显示种植体(黑色)与骨组织(蓝色)结合紧密，边缘软组织保留完整，切片无杂质无划痕(图1b、c)。

2.2 C、D、E组织切片苏木精-伊红染色结果

C、D、E组织切片苏木精-伊红染色后，细胞核呈蓝色，胞浆呈红色，新生骨组织一般呈浅红色。C组织切片在光学显微镜下观察示种植钉螺纹(黑色)附近有大量新生骨(绿色箭头处)，新生骨小梁(黄色箭头处)靠近种植钉生长，旧骨髓腔内疏松软组织(浅黄色)清晰可见，整体染色均匀(图1d、e)。D组织切片在光学显微镜下观察显示钛材料(黑色)与原旧骨(深红色)结合紧密，而且周围明显附着大量的新生骨(绿色箭头处)，种植体无移动脱落现象，原旧骨无缺损，腔内疏松软组织(浅黄色)清晰完整(图1f、g)。E组织切片在光学显微镜下观察显示，支架材料(黑色)保持在原位，无脱落现象，血管壁(浅红色)分层明显无缺损(图1h、i)。

2.3 F组织的荧光显微镜观察结果

荧光显微镜下F组织切片的钙黄绿素(绿色)和茜素络合物(红色)所发出的荧光清晰可见(图1j、k)，通道叠加图可清晰看到荧光分布和走向(图1l)。

3 讨 论

硬组织切片技术是近年来快速发展起来的一种新兴技术，无需脱钙处理，组织经固定、脱水、包埋、切片、磨片与染色后制成切片，既缩短了制片周期，又保护了组织的完整性，因高效快捷而迅速被推广应用[9-14]。因为EXAKT硬组织切磨系统的切割带含有等粒径金刚石颗粒，磨片用的砂纸含有碳化硅颗粒，硬度较高，可以用来切割钛合金或钴铬合金等硬度较高的种植体，制成的切片厚度均一，组织结构形态保持完好，染色后可以通过光学显微镜下观察，也可以通过电镜下观察；还可用于切割纤维桩等材料，而且切出的材料厚度均匀一致，表面光滑，无需打磨，所以该技术在组织切片制作中成为更多科研工作者的首选[15-16]。硬组织切片染色方法较多，常用的有甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色、Ladewig染色、Van-Gieson染色、Giemsa染色等[17-19]，通过对颜色、位置、骨界面定量分析，可以观察牙结石、龋病的发生、种植体与骨组织的结合、新骨生成、血管炎症反应、种植体表面成骨的细微变化等情况。

a:A组织切片Ladewig染色结果(100倍)；b、c：B组织切片Ladewig染色结果(4、100倍)；d、e：C组织切片苏木精-伊红染色结果(4、100倍)；f、g:D组织切片苏木精-伊红染色结果(4、100倍)；h、i：E组织切片苏木精-伊红染色结果(4、100倍)；j、k、l：F组织切片荧光显微镜下观察结果(100倍)

图1 组织切片镜下观察结果

本研究选取了具有代表性的6种组织类型，含有钛合金种植钉的比格犬颌骨组织在口腔医学研究中是最为常见的组织，该类组织的骨成分复杂，种植钉较大；含有钛合金直钉和螺纹种植钉的小鼠股骨相对来讲骨组织较为单一，种植钉较小；含有多孔钛材料的兔股骨踝骨是植入金属球的组织代表[20-21]，该类组织制作切片时植入物与骨组织结合不牢固易脱出；含有钴铬支架的兔心血管组织是植入细小金属支架的代表，该类组织是心脑血管研究中较为常见的组织类型；含有钙黄绿素和茜素络合物标记的大鼠上腭组织是荧光素标记的组织代表，组织中的荧光素在普通切片制作中易丢失[22]。

本研究的组织切片主要进行了两组染色，Ladewig染色对软组织的着色更加明显，软组织呈黄色，骨组织呈蓝色，并且可以清晰地显示骨的疏密程度；苏木精-伊红染色是组织切片的常规染色方法，可以观察骨组织基本结构[23-26]。A和B组织切片经染色后可见边缘完整的黄色软组织，蓝色骨组织与种植钉结合紧密，螺纹边缘也出现新生骨。C组织切片经染色后可观察到螺纹边缘有大量新生骨，髓腔内的疏松软组织完整；D组织切片经染色后可见钛材料周围有大量新生骨，颜色相对原生骨较浅，腔内软组织未脱落；E组织经染色后可见支架，未发生位移和脱落，血管壁分层明显。因此，对于外围附着有软组织及组分相对复杂的骨组织(如颌骨组织)可以选用Ladewig染色，组分相对单一的股骨、胫骨及血管等组织可以选用苏木精-伊红染色。

硬组织切片技术工艺复杂，制片流程环环相扣，稍有失误则会影响后续制片，因此该技术在操作的过程中要注意以下问题：①组织固定浸润操作过程中应注意时间的把握。组织固定结束后流水充分冲洗[27-28]，将固定液洗净，若有残留固定液则会影响后期染色的效果，含有荧光素标记的组织用体积分数0.75的乙醇溶液固定，甲醛或多聚甲醛溶液会对荧光素产生破坏，从而影响结果分析；脱水浸润时间要充足，若浸润不完全，包埋过后组织内部会出现大量空洞，或者出现组织外周硬中间软的现象，制片过程中极易脱片，严重影响切片质量。②组织包埋过程中注意避免出现气泡。包埋前轻轻震荡模具，将光固化树脂内部的气泡振出，或将模具放入骨组织切片修复机内抽真空1 h，将气体抽出，若残存大量气泡，包埋结束后组织周边会出现空洞，影响切片质量。③组织切磨片过程中避免出现气泡和划痕。粘接载片时注意动作要慢要轻，避免产生气泡，粘合剂7210应适量，过多会从上载片溢出，损坏载片真空吸附装置，过少会导致粘合不完全，边缘翘起易脱片；磨片时按照砂砾由大到小逐级打磨，若打磨不充分，会产生大量黑色划痕，影响观察效果；打磨带有金属支架的血管组织时要低速慢磨，否则金属材料极易从血管内壁脱落[29-30]。④组织切片染色前应注意载片清洁使染色更加美观。含有荧光素的切片应先在荧光显微镜下观察发光情况并保存数据后再进行染色，如果先行染色，染料会遮盖荧光信号，镜下观察时模糊不清，严重影响荧光结果分析；切片染色前用软毛刷清洁载片表面，清除磨片过程中粘附在载片上的杂质颗粒，使染色清晰美观，染色时尽量避免滴染，否则易造成着色不均匀，影响染色效果[31]。⑤封片时应注意中性树胶的用量，封好的切片应注意保存。封片时中性树胶不可滴加过多，否则切片不易干，盖玻片与组织之间易滑动，影响观察，封好的切片应放置在阴凉通风处，避免阳光直射，避免放在空调房等比较干燥的环境。

综上所述，EXAKT硬组织切磨技术可将含有金属植入物、骨粉、荧光标记的各种软硬组织制成高质量的薄切片，切片厚度均匀，划痕极少，稳定性高，在显微镜下可清晰地观察到软硬组织形态及荧光标记，经各种染色后可进行骨界面、骨愈合的定量分析，在骨科等组织形态研究领域有广泛的应用前景。