2,3-吲哚醌对乳腺癌BT549细胞生长的抑制作用及其机制

(1 青岛大学医学部基础医学院，山东 青岛 266021； 2 中山大学肿瘤防治中心神经外科； 3 青岛大学药学院)

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球女性癌症死亡的主要原因。乳腺癌的不同分子亚型与其治疗效果和预后密切相关，临床上，根据受体表达情况，大致把乳腺癌分为Luminal A、Luminal B、三阴性型和HER-2过表达型4种亚型[1]。三阴性乳腺癌占所有乳腺癌病例的15%～20%[2]，因其侵袭性强、病情进展快等特点，给临床上患者治疗带来严重的困难。目前三阴性乳腺癌的临床治疗方法主要是化疗[3]，但化疗后复发率高，且3年内生存率低。此外，三阴性乳腺癌由于易发生侵袭性肺转移和脑转移，死亡率更高[4-6]。目前治疗三阴性乳腺癌的化疗药物效果有限，且靶向治疗药物欠缺，因此亟待研究出新的治疗三阴性乳腺癌的药物。随着天然药物在抗肿瘤中的应用，吲哚类药物的研发日益引起人们的关注。2,3-吲哚醌又名吲哚-2,3-二酮，是抗癌药物靛玉红的衍生物，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等多种生物学活性[7-9]，且分子结构小、毒性低，具有开发为治疗三阴性乳腺癌化疗新药的潜能。

细胞凋亡的失调是癌症发病机制的一个重要的方面[10-11]。p53基因(p53)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)调控的家族蛋白是重要的凋亡相关蛋白，也是治疗癌症的潜在靶点[12-13]。MDM2基因(MDM2)是一种致癌基因，还是肿瘤抑制因子p53最重要的负性调控因子，破坏p53与MDM2之间的相互作用，能使p53稳定并激活[14]。因此，p53与MDM2之间互相调节，关系密切，可成为一个潜在的药物作用靶点。本研究通过检测BT549细胞中p53、Bcl-2、Bax以及MDM2 mRNA及蛋白的相对表达情况，探讨2,3-吲哚醌对三阴性乳腺癌BT549细胞的抑制作用及分子机制，以期为2,3-吲哚醌的药物研发提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

乳腺癌BT549细胞购自中国科学院昆明细胞库；2,3-吲哚醌购自美国Sigma公司； DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；青链霉素混合液、胰蛋白酶消化液购自中国北京索莱宝科技有限公司；PCR反转录试剂盒及引物购自北京全式金生物有限公司；BCA 蛋白质定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗人GAPDH单克隆抗体、P53、Bcl-2、Bax、MDM2抗体购自英国Abcam公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 细胞培养及处理

使用含体积分数0.10胎牛血清以及0.01青链霉素溶液的高糖DMEM培养基常规培养乳腺癌BT549细胞，当培养瓶中细胞生长率达到60%左右的状态时，加入梯度浓度2,3-吲哚醌后继续培养细胞至72 h。2,3-吲哚醌使用二甲亚砜溶解，根据实验需要，使用时用培养基稀释为相应浓度。

1.3 2,3-吲哚醌对乳腺癌BT549细胞的抑制作用和毒性

在96孔板中常规培养BT549细胞，当96孔板中细胞的生长率达到60%左右时，分别加入0、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L 的2,3-吲哚醌(每个浓度值设置5个实验复孔)，放入培养箱继续培养72 h。然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，并放回培养箱继续孵化2 h，后使用酶标仪检测各孔的吸光度(A)值。实验重复3次，取均值。根据抑制率公式计算2,3-吲哚醌对BT549细胞的抑制率，并采用SPSS统计软件计算半数有效抑制浓度(IC50)。

1.4 2,3-吲哚醌对乳腺癌BT549细胞侵袭、迁移的抑制作用

1.4.1划痕实验 在6孔板之中常规培养BT549细胞，当生长率达到60%左右时，分别加入不同浓度2,3-吲哚醌(0、100、200、400 μmol/L)处理后继续培养。细胞长满后，用微移液管的尖端在每个孔中垂直和水平各画2条线，并在不同的时间点(0、12、24 h)使用显微镜拍照，观察划痕愈合的情况。

1.4.2Transwell实验 在24孔板当中常规培养BT549细胞，当生长率达到60%左右时，加入不同浓度2,3-吲哚醌(0、100、200、400 μmol/L)处理后继续培养72 h。将Matrigel基质胶与无血清培养液放置培养箱中孵育1 h后，使基质胶凝固。将上述加药培养后的细胞配成细胞悬液，于每孔上室加入100 μL细胞悬液，下室中加入600 μL含体积分数为0.10胎牛血清的培养基，放置于培养箱中继续孵育，直至观察到下室有细胞出现时终止培养。取出Transwell小室用PBS洗2次，甲醛固定，结晶紫染色5 min，PBS洗2次，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下拍照计数，每个浓度设置3个实验复孔。

1.5 实时定量PCR(qPCR)方法检测细胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相对表达量

常规培养BT549细胞，生长率达到60%左右时，分别加入0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌处理后继续培养72 h，采用trizol试剂提取BT549细胞的总RNA。RNA浓度测定后，进行PCR反转录和qPCR实验，模板cDNA使用全式金逆转录试剂盒构建，qPCR体系采用全式金试剂盒构建。引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 Western blot实验检测细胞中MDM2、Bcl-2、Bax、P53蛋白相对表达量

取对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后加入0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌处理72 h，提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭液室温封闭2 h，加内参照一抗和目标蛋白一抗(1∶1 000)在4 ℃条件下孵育过夜。然后使用1×TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗溶液孵育1 h，再次用1×TBST洗膜10 min，重复3次。最后将ECL发光液按说明书加到PVDF膜上，室温放置1 min，放入成像系统显影并拍照。以GAPDH的条带结果为内参照，将目的蛋白的条带与内参照进行比较，得出目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 2,3-吲哚醌对BT549细胞增殖的抑制作用

CCK-8实验结果显示，0～1 600 μmol/L组的细胞增殖率分别为1.00±0.00、0.98±0.04、0.92±0.02、0.81±0.04、0.62±0.04、0.43±0.02、0.21±0.06。与0 μmol/L组比较，2,3-吲哚醌的药物浓度越高，BT549细胞的增殖率越低，差异具有统计学意义(F=74.64，P<0.01)。使用SPSS Statistics软件计算得出2,3-吲哚醌对BT549细胞的IC50为609 μmol/L，最终筛选出0、100、200、400 μmol/L的2,3-吲哚醌为后续实验的药物浓度。

2.2 2,3-吲哚醌对BT549细胞侵袭和迁移的抑制作用

Transwell实验显示，0、100、200、400 μmol/L组细胞的侵袭率分别为92.00±1.15、58.00±1.15、22.33±1.45、16.33±1.33。与0 μmol/L组比较，随着2,3-吲哚醌浓度的升高，BT549细胞的侵袭能力逐渐减弱(F=751.48，P<0.01)。见图1。划痕实验结果表明，0、100、200、400 μmol/L组细胞的迁移率分别为0.80±0.01、0.72±0.03、0.45±0.02、0.21±0.03。与0 μmol/L组相比较，2,3-吲哚醌的浓度越高，BT549细胞的迁移能力越低 (F=314.67，P<0.01)。见图2。

2.3 各组细胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相对表达量的比较

qPCR方法检测结果显示，与0 μmol/L组相比较，随着2,3-吲哚醌浓度的逐步升高，细胞中p53及BaxmRNA的相对表达量逐渐增高(F=62.82、20.86，P<0.01)，Bcl-2、MDM2 mRNA相对表达量逐渐下降(F=21.53、30.31，P<0.01)。见表2。

表2 各组细胞中p53、Bcl-2、Bax、MDM2 mRNA相对表达量比较

2.4 各组细胞中P53、Bcl-2、Bax、MDM2蛋白相对表达量比较

Western blot 检测结果显示，与0 μmol/L组比较，随着药物浓度增高，细胞中P53、Bax蛋白的相对表达水平逐渐增高(F=29.59、53.12，P<0.01)，Bcl-2和MDM2蛋白相对表达水平逐渐降低(F=14.85、159.81，P<0.01)。见表3、图3。

A、B、C、D分别经0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌处理

A、B、C、D分别经0、100、200、400 μmol/L 2,3-吲哚醌处理

表3 各组细胞中P53、Bcl-2、Bax、MDM2蛋白的相对表达量比较

图3 Western blot实验检测各组细胞中相关蛋白的表达水平

3 讨 论

三阴性乳腺癌约占乳腺癌的15%，在乳腺癌1型突变相关的患者中，80%以上发展为三阴性乳腺癌[15]。目前，三阴性乳腺癌的治疗方法主要有手术、化疗和放疗，但手术风险高，化疗敏感性较低，且易产生耐药性，肿瘤复发率高[16]，严重地威胁着女性的健康，因此，开发靶向治疗三阴性乳腺癌的新型药物是科研人员的研究热点，也是临床上治疗乳腺癌的迫切需要。

目前，三阴性乳腺癌的化疗药物主要是蒽环类、紫杉类和铂类药物，但是部分患者对化疗药物易产生耐药性，且预后差，效果差强人意[17]。2,3-吲哚醌是一种内源性生物因子，分布广泛，具有多种生物活性和药理活性[18]，其分子量小，化学结构简单，毒副作用小，具有开发为抗肿瘤药物的潜能。研究表明，在抗癌药物舒尼替尼和磷酸托塞拉尼布中，2,3-吲哚醌是其重要的药效单位[19]。此外，2,3-吲哚醌还能抑制神经母细胞瘤的增殖、侵袭以及转移[20]。2,3-吲哚醌的合成衍生物对乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231具有抗增殖的作用[21]。可见，2,3-吲哚醌与肿瘤的发生密切相关。p53是一种重要的抑癌基因，可参与肿瘤的多种生物学过程，在肿瘤的发生发展中具有重要作用[22]。p53是与人类肿瘤相关性最高的基因，大约50%的恶性肿瘤与p53的功能丧失有关[23]。2,3-吲哚醌发挥抑制肿瘤作用的分子机制是否与p53有关，目前尚不清楚。因此本研究主要探讨2,3-吲哚醌能否通过P53信号通路来抑制三阴性乳腺癌BT549细胞的增殖、侵袭和转移。

本研究中使用不同浓度的2,3-吲哚醌处理人乳腺癌BT549细胞72 h后，CCK8实验检测显示，随着2,3-吲哚醌浓度增加，细胞增殖明显被抑制。Transwell实验和划痕实验表明，2,3-吲哚醌对乳腺癌BT549细胞有明显的抑制侵袭以及迁移的作用。qPCR和Western blot实验分别检测了加药处理后，细胞中p53、Bax、Bcl-2和MDM2 mRNA相对表达量和P53、Bax、Bcl-2和MDM2蛋白相对表达量的变化，结果发现p53、BaxmRNA的相对表达量以及P53、Bax蛋白相对表达量逐渐升高，Bax和MDM2的mRNA相对表达量以及Bax、MDM2蛋白相对表达量逐渐降低，证明了2,3-吲哚醌很可能通过激活P53信号通路抑制乳腺癌BT549细胞的增殖、侵袭和转移。此研究为研发2,3-吲哚醌治疗三阴性乳腺癌提供了基本的理论基础，但只是在体外水平上验证了2,3-吲哚醌对乳腺癌BT549细胞的作用，后续的体内实验及分子机制还需要进一步的研究。

综上所述2,3-吲哚醌对三阴性乳腺癌BT549细胞具有明显的抑制作用，且其机制可能是通过激活P53信号通路抑制细胞的增殖、侵袭和转移，初步显示了2,3-吲哚醌具有开发为治疗三阴性乳腺癌化疗新药的潜能。