PRRX1对乳腺癌多药耐药发生的影响及其机制

(青岛大学附属医院乳腺病诊疗中心，山东 青岛 266003)

乳腺癌是目前发病率较高的肿瘤之一[1]。在乳腺癌的综合治疗中，化疗占有十分重要的地位。但多药耐药(MDR)即癌细胞同时对不同药物产生交叉耐药性仍然是化疗成功的主要障碍[2]。在MDR的众多原因中，由MDR1编码的P-糖蛋白(P-gp)过表达发挥着重要作用，可在药物到达细胞内靶点前即被拦截和排出胞外[3]。P-gp的过表达也会使乳腺癌细胞对治疗中的许多常用药物产生耐药性，如蒽环类、紫杉类、长春碱类药物等[4]。因此，逆转MDR、提高患者的化疗疗效成为乳腺癌治疗中最大的挑战之一。上皮-间质转化(EMT)是指上皮细胞转化为间质细胞的过程。发生EMT的细胞失去极性，细胞间连接松散，并伴随EMT标记物如N-钙黏蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(vimentin)表达的改变[5]，导致肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强，这是

肿瘤细胞发生转移的潜在机制[6]。配对相关同源框1(PRRX1)已被证实为一个新的EMT的诱导因子，可使乳腺癌[7]、大肠癌[8]、胰腺癌[9]、胃癌[10]和头颈癌[11]等肿瘤细胞发生EMT。其过表达可以增强乳腺癌细胞的迁移性和侵袭性[12]，但其在乳腺癌MDR中的作用鲜有报道。本研究旨在探讨EMT诱导因子PRRX1在乳腺癌MDR中的作用及其分子机制，并为乳腺癌治疗和预防提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞分组及瞬时转染

乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院上海细胞研究所，将细胞接种于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM培养基(美国HyClone公司)并置于37 ℃含体积分数0.05的CO2的恒温培养箱中培养。当细胞融合达80%以后分离接种于24孔板中，细胞按照处理方法不同分为3组，未处理的MCF-7细胞作为空白对照组(A组)，转染空白pEX-3载体(上海吉玛制药技术有限公司)的MCF-7细胞作为阴性对照组(B组)，转染携带PRRX1基因的重组质粒(上海吉玛制药技术有限公司)的MCF-7细胞作为实验组(C组)。B、C组细胞于转染前1 d更换培养基，使用Lipofecta-mine 2000(美国Iivitrogen公司)试剂进行转染。转染48 h后，用倒置荧光显微镜观察细胞形态及转染情况。收集3组细胞(约9×105个/孔)用于后续相关基因和蛋白分析测定。

1.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测各组细胞当中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp mRNA的表达

从3组MCF-7细胞中提取总RNA并反转录成cDNA。然后采用Gene Amp 2400 PCR仪(美国PE公司)进行RT-qPCR。RT-qPCR的反应条件为：95 ℃预变性30 s；然后98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共进行40个循环；最后95 ℃延伸1 min。以β-Actin作为内参基因，使用2-△△CT方法计算各组细胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gpmRNA的相对表达量。引物序列见表1。

1.3 WES蛋白质印迹定量分析系统检测各组细胞PRRX1、N-cadherin、vimentin及P-gp蛋白的表达

以蛋白裂解液提取各组细胞的总蛋白以后，用BCA法测定蛋白浓度。将不同组别蛋白质溶液调成相同浓度。依照说明书将Ladder加入WES试剂盒检测板第一行第1孔，其余24孔依次循环加入3组等浓度蛋白质溶液，第2行加入抗体稀释液，第3行加入β-Actin、PRRX1、N-cadherin、Vimentin及P-gp一抗，第4行加入与各一抗对应的二抗，第5行加入发光液，最后加入缓冲液。离心并上机操作，运行完成后采用Compass软件分析目标蛋白的相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列和产物长度

1.4 CCK-8检测细胞半数抑制浓度(IC50)

取对数生长期的3组MCF-7细胞(4 000个/孔)接种于96孔板中。细胞贴壁后加入化疗药物多西他赛和顺铂(北京索莱宝科技有限公司)。多西他赛的最终浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 μmol/L，顺铂的最终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 μmol/L。每个浓度设3个复孔，未加药的孔作为对照孔，加不含细胞的完全培养基的孔为调零孔。加入药物24 h后，每孔添加CCK-8试剂10 μL混合后，再放回培养箱孵育1 h，采用酶标仪于波长450 nm处测量各孔吸光度值。用GraphPad Prism 6软件计算各组细胞的IC50。

1.5 统计分析

2 结 果

2.1 各组细胞的转染情况

倒置荧光显微镜下观察显示，A组未见荧光(图1A)，B组和C组均可见绿色荧光(图1B、C)，转染效率约为80%。A组和B组的细胞间均连接紧密，呈“铺路石”状(图1D、E)，而C组细胞间连接松散，呈“纺锤形”(图1F)。

2.2 各组细胞中PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白表达情况

3组细胞中的PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gpmRNA及蛋白表达水平比较差异均具有显著性(F=7.08～23.39，P<0.05)。其中C组上述4种因子的 mRNA及蛋白表达水平均明显高于A、B两组(t=3.02～10.92，P<0.05)，A、B两组比较差异均无显著性(P>0.05)。见表2。

2.3 各组细胞多西他赛和顺铂处理后的IC50

多西他赛对A、B、C组细胞的IC50分别为0.45±0.06、0.44±0.06、1.29±0.14，顺铂对A、B、C组细胞的IC50分别为0.60±0.07、0.59±0.11、1.73±0.23，两种药物对3组细胞的IC50比较差异均具有显著性(F=26.84、7.081，P<0.01)；其中两种药物对C组细胞的IC50明显高于A、B两组(t=4.54～5.68，P<0.05)；而两种药物对A、B组细胞的IC50比较差异无显著性(P>0.05)。

A～C：A～C组细胞,荧光，200倍；D～F：A～C组细胞,普通光，200倍

表2 各组细胞PRRX1、N-cadherin、vimentin、P-gp mRNA及蛋白相对表达量比较

3 讨 论

化疗是乳腺癌最重要的治疗手段之一，但由于患者易出现MDR而严重降低药物疗效，致使患者病情复发和预后不佳。逆转肿瘤细胞的MDR对提高乳腺癌的治疗效果至关重要，也是国内外学者高度关注的热点[13-14]。

大量研究表明，EMT与化疗药物的耐药有着密切的关系[15-17]。在EMT过程中，维持上皮表型的重要黏附分子被间质表型分子如N-Cadherin及vimentin所取代，从而导致细胞间黏附性降低，细胞迁移侵袭能力增强[18]。N-cadherin和vimentin不仅仅是EMT的重要标志物，目前发现其与肿瘤的MDR也具有密切关系[19]。FISCHER等[20]研究显示EMT可通过激活乳腺癌细胞中的乙醛脱氢酶来诱导其对环磷酰胺耐药。SAXENA等[21]也发现EMT诱导物不仅可以增加肿瘤细胞的侵袭性，还可通过上调ABC转运蛋白的表达，增加化疗药物的外排而致使耐药的发生。LI等[22]发现阿霉素可诱导乳腺癌细胞系发生EMT和MDR，并且只有发生EMT的细胞侵袭性会增加并出现MDR，抑制EMT可逆转其MDR。PRRX1是一种新发现的EMT诱导因子，能诱导癌细胞发生EMT并增加其侵袭性[7]。在乳腺癌中，PRRX1的表达与淋巴结转移、临床分期以及患者5年生存率显著相关[23]。LV等[24]研究结果显示PRRX1的主要亚型之一PRRX1b在三阴性乳腺癌中显著上调，并与肿瘤大小和周围血管的侵犯程度相关。PRRX1b的沉默可抑制基底样癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，PRRX1过表达可使乳腺癌MCF-7细胞系发生EMT改变，细胞间连结松散，细胞呈纺锤形，利于细胞运动迁移，并伴随间质表型标志分子N-cadherin和vimentin表达的增加，这与先前的研究结果相符[5，7]。

然而PRRX1在MDR中的作用尚不清楚。最近的研究表明PRRX1高表达可诱导大肠癌EMT，与其转移、预后不良及放疗耐受相关[8，25]。而在肺癌细胞中沉默PRRX1可诱导EMT并增加肺癌细胞抗凋亡能力和对顺铂的耐药性[26-27]。上述研究提示PRRX1在不同类型的癌症细胞中发挥着不同的作用。本研究结果亦显示，用多西他赛和顺铂分别处理乳腺癌MCF-7细胞24 h后，C组细胞的IC50值明显高于A组和B组，提示PRRX1过表达可致使乳腺癌细胞发生MDR。在肿瘤细胞系中，ABC转运蛋白的过表达可增加药物外排从而降低细胞内药物浓度，是肿瘤细胞获得耐药性最主要的机制之一[28-29]。由MDR1基因编码的P-gp，又称ABCB1，是研究最深入的ABC蛋白，长期以来被认为是克服肿瘤MDR的重要靶点[30]。P-gp不仅介导肿瘤细胞的MDR，而且参与调节其增殖、凋亡、迁移、侵袭及EMT等[31]。本研究通过RT-qPCR和WES蛋白定量分析系统检测了3组细胞中P-gpmRNA和蛋白的相对表达量，结果显示C组细胞的P-gpmRNA及蛋白表达水平较A、B两组均明显增高，提示PRRX1可能通过上调乳腺癌MCF-7细胞中P-gp的表达，介导MDR的发生。

综上所述，本研究首次发现PRRX1过表达可通过诱导乳腺癌MCF-7细胞EMT而致使其发生MDR，对乳腺癌MDR发生机制的研究提供了新的思路。但MDR机制错综复杂，PRRX1参与这一过程的分子机制还有待进一步深入研究。