柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠模型胃肠平滑肌细胞MLCK表达的影响❋

彭 雷，程阔菊，朱 丹，罗 云△，程 俊

(1.四川省达州市中西医结合医院, 四川 达州 635000；2.西南医科大学心肌电生理研究室, 四川 泸州 646000)

大量临床和基础研究已证实，柴胡疏肝散能显著改善胃肠功能紊乱，主要表现为改善胃肠运动功能[1-2]，但其具体作用机制尚不明确。平滑肌细胞是胃肠运动功能的执行细胞，而Ca2+-CaM-MLCK是平滑肌细胞运动调控系统中的第二信号系统，在调控平滑肌细胞运动中起着主要作用[3]。那么柴胡疏肝散有没有可能通过Ca2+-CaM-MLCK信号系统发挥作用，目前尚无相关文献报道。鉴于此，本研究拟选择Ca2+-CaM-MLCK的下游靶点肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)为研究点，观察柴胡疏肝散汤剂对胃肠功能紊乱大鼠胃肠平滑肌细胞MLCK表达的影响。

1 材料

1.1 实验动物

雄性SPF级SD大鼠，8周龄，体质量(200±20)g，由成都达硕生物科技有限公司提供(合格证号SCXK(川2008-24)。本实验已通过西南医科大学实验动物伦理委员会审查。

1.2 主要设备与试剂

柴胡疏肝散各味药材，购自达州市中西医结合医院中药房(均附鉴定证书和合格证书)；利血平(天津金耀药业有限公司(批号1501161)；LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche)；一抗，MLCK、β-actin(abcam)；荧光二抗、DAPI(谷歌生物)；LightCycler480(Roche)，Odyssey 扫描成像系统(LICOR,USA)；倒置荧光显微镜(Leica,Nikon Eclipse Ti-SR)；切片机(Leica,Leica UC7)；钻石切片刀(Daitome,Ultra 45°)。

2 方法

2.1 药物制备

柴胡疏肝散汤剂组成：陈皮、柴胡各120 g，川芎、枳壳(麸炒)、芍药各90 g，甘草(炙)30 g，香附90 g。药材经清洗后温水1000 ml浸泡1 h，后煎煮30 min，提取2次，再合并水煎液，冰箱中保存备用。

2.2 模型制备及分组

实验分组取雄性SD大鼠80只，按随机数字表法分为sham组(对照组)、FGID组(模型组，FGID：functional gastrointestinal disorders)、sham+柴胡疏肝散组、FGID+柴胡疏肝散组4组各20只。为观察柴胡疏肝散对正常大鼠胃肠功能是否有不良影响，本研究设计了sham+柴胡疏肝散组。

模型制备：FGID组参考王晓燕的方法[4]，按照0.5 mg/kg·d的剂量连续腹腔注射利血平14 d。sham组给予模型组利血平同等剂量的生理盐水。

给药剂量及途径选择根据前期预实验结果，药物组按照每只大鼠30 ml/Kg/d的柴胡疏肝散汤剂剂量，分2次早晚灌服大鼠，与造模同时进行，与利血平腹腔注射时间间隔2 h，对照组给予等量灭菌注射用水灌胃。

2.3 动物模型评价

根据人类胃肠功能紊乱的临床诊断标准并结合大鼠的生物学特性，国内外较为公认的大鼠胃肠功能紊乱动物模型的评价标准，主要包括胃肠运动功能障碍和病理组织学表现两个方面[3-4]。

2.3.1 胃肠运动功能检测 包括胃肠生物电检测、胃排空实验和小肠推进实验。

(1)胃肠生物电检测：参照文献[2]的方法，大鼠经戊巴比妥麻醉后仰卧位固定，剑突下腹部正中切口暴露胃和小肠。在胃窦距离幽门0.5 cm处的浆膜下安放一对银丝电极，在距屈氏韧带1 cm处的小肠对系膜浆肌层内安置一对银丝电极。固定电极，关闭腹腔，电极另一端连接BL-420F生物机能实验系统，时间常数5 s，高频率波30 Hz，增益2000。预适应30 min后以每10 min为一个时间段，分别记录大鼠胃、小肠的在体慢波，连续记录80 min。计算每组实验动物每个时间段的慢波频率、振幅、慢波频率变异系数和慢波振幅变异系数。

(2)胃排空实验：从第14天晚开始禁食不禁水至第16天早8点，共计36 h。给予事先配制好的营养半固体饮食3 mL，30 min后用戊巴比妥麻醉，打开腹腔结扎幽门和贲门，腹主动脉放血后取胃，清除胃表面血渍，称重计量为M1，剪开胃体，清除胃内容物，用滤纸吸干水分称重为M2，计算胃残留率：(M1-M2)/所灌半固体饮食质量×100%。

(3)小肠推进实验：参照文献[2]方法，用丝线结扎胃幽门和小肠回盲部，分离肠系膜，测量幽门至回盲部的距离作为小肠的总产度计为L1，幽门至小肠营养湖黑染的距离作为小肠推进的长度计为L2，计算小肠推进率=(L1-L2)/L1×100%。

2.3.2 组织病理学检测 实验结束后，取大鼠胃窦组织、小肠中段1.5 cm，用生理盐水洗净胃肠内容物，迅速将组织置于固定液(4%多聚甲醛)中固定2 h，常规乙醇逐级脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、脱蜡，苏木素-伊红染色、脱水、封片，光学显微镜下观察组织细胞形态并照相并记录。

2.4 免疫荧光检测

待胃运动功能检测结束后，剥离出大鼠胃窦和结肠肌层，经丙酮固定，常规乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片、脱蜡，抗原修复，画圈自发荧光淬灭，血清封闭，加一抗、二抗，DAPI复染细胞核，荧光淬灭剂封片，于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

2.5 Western blot检测

胃肠肌层组织粉粹研磨同上，组织研磨结束后每EP管加入1 ml 预冷的RIPA buffer 裂解液，置冰上用超声裂解仪充分裂解组织，于4°下12000r/min 离心30 min，收集上清液即为细胞的总蛋白溶解液。利用BCA Protein Assay Kit 对蛋白浓度定量后，根据浓度加入5×SDS蛋白上样缓冲液，10×DTT，95 ℃水浴5 min，使蛋白变性。电泳结束后将蛋白转移至NC膜，后续加入MLCK、β-actin(rat)一抗及相应的二抗。采用Odyssey 扫描成像系统(LICOR,USA)对蛋白进行定量分析。

2.6 Real-Time PCR 检测

表1示，待胃肠运动功能检测结束后剥离胃窦和结肠黏膜，将肌层组织迅速放入经液氮预冷的无酶EP管(预先已放入研磨珠子)中，在研磨器中对组织进行充分粉粹研磨。研磨结束后，向EP管中加入1 ml Tripure Isolation Reagent，然后按照其说明书提取RNA，接着按照Transcriptor First Stand c DNA Synthsis Kit说明书将RAN 反转成cDNA。然后于LightCycler® 480仪器上应用LightCycler 480 SYBR Green I Master对MLCK进行Real-time PCR相对定量分析，内参为β-actin，Real-time PCR引物序列。

表1 MLCK、β-actin Real-time PCR引物相关信息比较

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠胃肠功能紊乱动物模型评价

表2图1示，造模结束后模型组胃肠运动功能表现为胃肠慢波频率及振幅显著下降(胃肠生物电检测)(P<0.05)，胃排空显著减慢(胃残留率增多)(P<0.05)，小肠推进率明显降低(P<0.05)；给予柴胡疏肝散处理后，胃肠慢波频率及振幅显著上升(P<0.05)，胃排空显著加快(P<0.05)，小肠推进率明显加快(P<0.05)，胃肠道组织病理学表现为无器质性病变。根据模型组大鼠的胃肠运动功能表现和组织病理学表现，可判定模型制作成功。

表2 大鼠胃肠功能紊乱动物模型胃肠运动功能检测

注：与sham组比较：*P<0.05；与FGID组比较：#P<0.05

注：sham:对照组；sham +药物:sham+柴胡疏肝散组;FGID:大鼠胃肠动物功能紊乱模型组; FGID+药物：FGID+柴胡疏肝散组

注：sham:对照组；sham +药物:sham+柴胡疏肝散组;FGID:大鼠胃肠动物功能紊乱模型组; FGID+药物：FGID+柴胡疏肝散组

3.2 柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠结肠肌层MLCK免疫荧光的影响

图2示，荧光显微镜下观察，正常大鼠(sham组)胃窦和结肠肌层内可见均匀的MLCK阳性表达，sham+柴胡疏肝散组与sham组相似，FGID组MLCK阳性表达显著减少，FGID+柴胡疏肝散组中MLCK阳性表达较FGID组显著增多。

3.3 柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃肠平滑肌MLCK蛋白表达的影响

图3示，模型组大鼠胃肠平滑肌细胞内MLCK的蛋白表达量显著减少(P<0.05)；柴胡疏肝散对正常大鼠胃肠平滑肌细胞内MLCK的蛋白表达量无影响(P≥0.05)，但可显著上调胃肠功能紊乱大鼠胃肠道MLCK的蛋白表达量(P<0.05)。

注：与sham组比较：*P<0.05；与FGID组比较：#P<0.05

3.4 柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃肠平滑肌MLCK的 mRNA表达量影响

图4示，模型组大鼠胃窦、结肠平滑肌细胞内MLCK的mRNA表达量显著减少(P<0.05)；柴胡疏肝散对正常大鼠胃窦、结肠平滑肌细胞内MLCK的mRNA表达量无影响(P≥0.05)；但可显著上调胃肠功能紊乱大鼠胃窦、结肠MLCK的mRNA表达量(P<0.05)。

4 讨论

胃肠功能紊乱是一种临床常见的非器质性功能性胃肠道疾病，以胃肠道运动功能障碍为主，临床表现为无器质性病变的腹泻、便秘、腹痛等消化系统症状，发病率约为40%，约占胃肠道疾病的40%～60%，并呈逐年上升趋势[5]，其发病机理复杂，临床缺乏有效的化学药物。临床和基础研究显示，柴胡疏肝散能显著改善胃肠功能紊乱症状[1-2]，但其具体作用机制尚不明确。随着中医药逐步走向国外，更多的国外学者要求中医药能提供现代的科学理论依据。

《景岳全书·古方八陈·散陈》云：“肝喜条达，主疏泄而藏血，其经脉布胁肋，循少腹”，因情志不遂、木失条达、肝失疏泄而致肝气郁结。多项研究指出，胃肠功能紊乱与肝失疏泄、脾失健运关系最为密切[6-8]。功能性消化不良的基本病机为肝郁犯脾、脾虚气滞，只有坚持疏肝理气、健脾燥湿，才能很快消除致病之根源，使临床症状减轻[9]。《素问·六元正纪大论篇》亦云:“木郁达之”，治宜疏肝理气之法。柴胡疏肝散由“醋炒陈皮、柴胡各二钱，川芎、麸炒枳壳、芍药各一钱半，炙甘草五分，香附一钱半”组成，功效疏肝理气止痛[10]。方中柴胡疏肝解郁为君药；香附理气疏肝，助柴胡解肝郁；川芎行气活血而止痛，助柴胡以解肝经之郁滞，二药相合增其行气止痛之功为臣药；陈皮、枳壳理气行滞；芍药、甘草养血柔肝、缓急止痛为佐药，诸药相合共奏疏肝行气、活血止痛之功，主治肝气郁滞证，使肝气条达，血脉通畅，营卫自和。

现代药理认为，胃肠舒缩运动由胃肠道平滑肌细胞执行，在平滑肌细胞内控制其舒缩运动的信号传导通路，包括肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和蛋白激酶C(PKC)2条途径，其中以MLCK途径为主[3]。当平滑肌细胞受到刺激引起细胞内钙增加时，游离的Ca2+与CaM结合形成Ca2+-CaM复合物，该复合物靠近MLCK，诱导MLCK发生构象改变激活MLCK，激活的MLCK使肌球蛋白第19位的丝氨酸或第18位的苏氨酸同时磷酸化，肌球蛋白磷酸化后引起自身伸展，其后头部的ATP酶活化释放能量使肌丝滑动，导致平滑肌收缩最终引起胃肠道收缩[11]。相反，当细胞内Ca2+降低时胃肠道舒张，可见主要是Ca2+-CaM-MLCK信号通路操纵着胃肠平滑肌细胞的舒缩状态，进而操纵着胃肠道的舒缩功能。MLCK作为该信号通路的下游蛋白，可直接或间接反映该信号通路的活化状态，因此该信号通路多以MLCK为研究靶点。

本研究利用腹腔注射利血平制备胃肠功能紊乱大鼠模型，胃运动功能表现为慢波频率及振幅下降，使胃排空减慢。利用Real-Time PCR、Westeron Blot、组织免疫荧光技术显示，在模型组大鼠的胃窦和结肠肌层平滑肌细胞中，MLCK的表达显著减少，应用柴胡疏肝散干预后MLCK表达显著增多，同时胃肠运动功能也得到显著改善。但柴胡疏肝散对正常大鼠胃肠运动功能、组织病理学、胃窦和结肠肌层平滑肌细胞中MLCK的表达无影响。

本研究证明，柴胡疏肝散对正常大鼠无作用，但可显著改善大鼠胃肠功能紊乱动物模型中胃肠运动功能，为临床安全应用提供了部分可靠的科学依据。就其现代机制研究认为，其中之一为调节胃肠道平滑肌细胞内MLCK的表达。郁怒伤肝，木不疏土，可致脾胃运化失调，而柴胡疏肝散则通过调控胃肠道MLCK的表达量，治疗胃肠功能紊乱和肝疏泄失调的表现，对于其余机制还有待进一步的深入研究。