香菇多糖对人乳腺癌细胞MCF-7行紫杉醇化疗的增敏作用

钟姣, 王哲, 吴洪斌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,化疗是临床治疗乳腺癌的主要手段之一,但随着化疗药物的长期使用,患者易对化疗药物产生抗药性,影响化疗的效果[1-2]。紫杉醇(PTX)是临床治疗肺癌、乳腺癌、胃癌等多种癌症的主要化疗药物之一,在长期的治疗过程中,患者易对PTX产生耐药性,极大影响了PTX的治疗效果[3]。研究表明,PTX化疗的不良反应会随着剂量的增加而增加[4]。

寻找一种既能减少PTX不良反应,逆转耐药性,又不影响其化疗效果的方法是提高化疗效果的关键。香菇多糖(LNT)是从香菇子中分离的最有效的生物活性成分,临床常作为免疫调节剂用于癌症的辅助治疗。现代药理学研究表明其具有调节免疫功能、抗病毒、抗肿瘤、降血脂等多种药理学作用,可以减轻化疗药物产生的多种不良反应[5]。但其对乳腺癌化疗的敏感性及其作用机制目前尚不清楚。本研究通过培养人乳腺癌MCF-7细胞,研究LNT对PTX治疗乳腺癌化疗敏感性的影响及其可能机制,为临床治疗乳腺癌的用药选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 人乳腺癌MCF-7细胞购自美国菌种保藏中心;LNT购自山西振东泰盛制药有限公司,国药准字H20064611;细胞培养基RPMI-1640、胎牛血清、Trizol总RNA提取试剂盒、实时荧光定量(RT)-PCR试剂盒、紫杉醇均购自赛默飞世尔科技公司;兔抗人Caspase-3、Bcl-2、Bax一抗与辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔二抗IgG均购自美国Santa Cruz公司;CO2培养箱购自美国REVCO;96孔板、12孔板、6孔板、超低温冰箱购自美国赛默飞世尔科技公司;全自动酶标仪购自美国Molecular Devices公司;实时定量PCR仪购自美国罗氏公司；离心机购自德国耶拿公司。

1.2 细胞培养及药物处理方法 采用含10%热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液培养人乳腺癌MCF-7细胞,于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞制成单细胞悬液,均分为对照组、PTX组、LNT组和LNT+PTX组,PTX组加入100 μl不同浓度的PTX(终浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 nmol/L)与细胞单独孵育24 h;LNT组加入100 μl LNT(0.1 μmol/L)与细胞单独孵育24 h;LNT+PTX组加入50 μl不同浓度的PTX(终浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 nmol/L)和50 μl 0.1 μmol/L LNT,与细胞孵育24 h;对照组只加入RPMI 1640培养液与等体积的DMSO,培养24 h后用于MTT检测。

1.3 MTT法检测MCF-7细胞抑制率 取对数生长期MCF-7细胞,以1×104个/ml将细胞悬液接种于96孔板,100 μl/孔,每组设6个复孔,培养过夜,与药物孵育24 h,弃培养液,每孔加入5 g/L的MTT溶液150 μl,培养4 h,弃MTT,150 μl DMSO作用30 min,用全自动酶标仪在570 nm波长下读取各孔吸光度(A)值,计算细胞抑制率(%)=(1-药物组A值/对照组A值)×100%,计算半数抑制浓度(IC50)值。

1.4 TUNEL法检测MCF-7细胞凋亡情况 取对数生长期MCF-7细胞,以1×105个/ml将细胞悬液接种于12孔板,PTX组加入4 nmol/L的PTX 100 μl与细胞单独孵育24 h;LNT组加入0.1 μmol/L的LNT 100 μl与细胞单独孵育24 h;LNT+PTX组加入4 nmol/L的PTX 50 μl和0.1 μmol/L的LNT 50 μl与细胞孵育24 h;对照组只加入RPMI 1640培养液与等体积的DMSO,每组设3个复孔。培养24 h后,制作细胞涂片,洗涤后置于4%多聚甲醛溶液固定,加入含0.1% TritonX-100的PBS冰浴2 min,洗涤2次,加入50 μl TUNEL检测液,37 ℃避光孵育60 min,加入100 μl打孔液,室温避光孵育10 min,加入100 μl DAPI,室温避光孵育10 min,加入0.1% TritonX-100的PBS洗涤3次,封片后置于荧光显微镜下观察,严格按照TUNEL试剂盒说明操作染色。

1.5 Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达 收集药物处理24 h后的各组细胞,提取MCF-7细胞总蛋白,每组设6个复孔,采用Bradford调整蛋白浓度一致,经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至甲醛预处理过的PVDF膜,密封2 h,洗膜并加一抗4 ℃孵育过夜,洗膜加二抗室温孵育2 h。再用ECL化学发光显示,收集影像,以β-actin作为内参,采用凝胶图像处理系统软件半定量分析各组的条带灰度值。

1.6 RT-PCR检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)、多药耐药基因1(MDR1)及乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的表达 收集药物处理24 h后的各组细胞,Trizol法提取MCF-7细胞总RNA,经反转录合成cDNA,行RT-PCR反应,以GAPDH作为内参,反应引物、体系和条件参考郑晓辉等[6]的研究。

2 结果

2.1 PTX组与LNT+PTX组的MCF-7细胞抑制率比较 PTX和LNT+PTX对乳腺癌细胞的抑制率呈药物浓度依赖性,当PTX浓度达到4 nmol/L时,其抑制作用趋于最大,选择4 nmol/L PTX进行后续试验(图1)。与PTX组相比,LNT+PTX组在各个浓度下的抑制率均显著升高(P<0.05);培养24 h后,LNT+PTX组的IC50低于PTX组[(0.82±0.06)nmol/Lvs.(1.72±0.13)nmol/L)]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 4组MCF-7细胞凋亡情况 PTX组MCF-7细胞的凋亡率明显高于对照组,LNT+PTX组细胞的凋亡率明显高于PTX组,差异均有统计学意义(P<0.05),见图2、表1。

图1 PTX组与LNT+PTX组的细胞抑制率比较

图2 TUNEL法检测MCF-7细胞凋亡情况(60 μm)注:箭头所指为凋亡小体

表1 4组MCF-7细胞凋亡率及Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

注:a与对照组比较,P<0.05;b与PTX组比较,P<0.05

2.3 各组细胞Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达水平比较 与对照组相比,LNT组Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达无显著差异(P>0.05),PTX和LNT+PTX组Caspase-3和Bax的蛋白表达量显著升高(P<0.05),Bcl-2的表达量显著降低(P<0.05);与PTX组相比,LNT+PTX组Caspase-3和Bax的蛋白表达量显著升高(P<0.05),Bcl-2的表达量显著降低(P<0.05),见图3、表1。

图3 4组细胞Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达

2.4 4组细胞耐药相关基因MDR1、MRP1和BCRP的表达水平比较 LNT组和LNT+PTX组的MDR1、MRP1和BCRP表达量低于对照组,LNT+PTX组的MDR1、MRP1和BCRP表达量低于PTX组,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 4组细胞MDR1、MRP1和BCRP的表达水平比较

注:a与对照组相比,P<0.05;b与PTX组相比,P<0.05

3 讨论

乳腺癌是由致癌因子侵袭而引起的细胞恶性增殖,化疗是其主要治疗手段之一[7]。PTX是从红豆杉或紫杉中提炼出的一种具有抗癌效果的萜类次级代谢产物,临床上常作为多种肿瘤的化疗药物之一[8]。PTX可以抑制细胞的有丝分裂,使细胞分裂增殖受阻,还可以诱导肿瘤细胞凋亡,从而达到抗肿瘤的作用[9-10]。已有多项研究表明,PTX是治疗转移性乳腺癌的一线药物,但长期的PTX治疗易使患者产生抗药性,且随着剂量的增加,化疗的不良反应也会相应的增加[11-12]。LNT作为一种免疫调节剂在临床上常用于多种癌症的辅助治疗,可较好抑制肿瘤增殖,提高机体免疫功能,减轻化疗药物产生的不良反应[13]。霍小蕾等[14]研究表明,LNT可以增强紫杉醇的抗肿瘤能力,促进食管癌细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的转移和迁移能力。本研究发现，LNT可以在一定程度上抑制细胞的增殖,可以显著增加PTX抑制细胞增殖的能力,提高PTX的IC50,提示LNT可以增强MCF-7细胞对PTX的敏感性;本研究中LNT促进MCF-7细胞凋亡的作用并不显著,但其可以显著增加PTX对MCF-7细胞的促凋亡作用,促进下游凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax的表达,抑制Bcl-2的表达。Caspase-3是凋亡执行分子,机体的死亡受体途径和Bcl-2/Bax调控的线粒体凋亡途径均需要Caspase-3的参与[15]。提示LNT可以增强MCF-7细胞对PTX的敏感性,促进PTX的细胞抑制和促凋亡作用。

乳腺癌患者治疗的后期往往会对化疗药物产生耐药,严重影响化疗的效果,从而导致临床乳腺癌治疗失败[16]。因此,研究乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药机制,寻找可以有效逆转耐药性的药物,对于提高乳腺癌化疗效果具有十分重要的意义。肿瘤多药耐药性的产生机制非常复杂,多项研究均显示MDR1及其编码产物BCRP和MRP1等均参与了耐药性的产生[17]。赵遵兰等[18]研究表明,在人乳腺癌细胞MCF-7紫杉醇耐药株中,耐药基因MDR1、BCRP、MRP1均有高表达。陈瑜等[19]研究表明,LNT可以显著下调MDR1和MRP1的表达,逆转卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。本研究发现,PTX对MCF-7细胞MDR1、BCRP、MRP1的表达影响不显著,LNT单用或与PTX联用时均可以显著下调MDR1、BCRP、MRP1的表达,提示LNT可能通过下调耐药相关基因MDR1、BCRP、MRP1的表达,逆转MCF-7细胞对PTX的耐药性,进一步增强MCF-7细胞对PTX的敏感性。

综上所述,LNT可以增强MCF-7细胞对PTX的敏感性,促进PTX诱导的细胞抑制和促凋亡作用;此外,LNT还可以下调耐药相关基因MDR1、BCRP、MRP1的表达,逆转MCF-7细胞对PTX的耐药性,进一步增强MCF-7细胞对PTX的敏感性。本研究为LNT在乳腺癌化疗中的应用提供了理论依据,但也存在一定的局限性,只研究了LNT能在体外促进人乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性,体内是否具有类似的作用仍需进一步研究。