七叶皂苷钠抑制大鼠晶状体组织氧化损伤的实验研究

李雅琢，徐甄，兰天野，张议文，张丽娟，刘平

七叶皂苷钠(sodium aescinate)因其具有较强的抗氧化、抗炎、改善微循环作用而用于各种脑缺血性疾病的治疗[1]。然而，国内外关于七叶皂苷钠对大鼠晶状体保护作用的研究却很少，但是有研究发现七叶皂苷钠高剂量处理组可以抑制晶状体上皮细胞内NF-κB 的活化表达，抑制通过紫外线照射方法诱导离体大鼠晶状体发生白内障[2]。本研究将七叶皂苷钠作用于氧化损伤诱导的白内障大鼠晶状体，观察该药物对晶状体组织透明度、晶状体上皮细胞形态、晶状体组织内还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力及NF-κB 蛋白表达的影响，以期为临床白内治疗障提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

七叶皂苷钠 (购于武汉普生制药有限公司)，NF-κB 抗体(上海碧云天公司)，还原性谷胱甘肽（GSH）及过氧化氢酶（CAT）试剂盒（南京建成生物工司），苏木素-伊红染色剂(武汉博士德生物工程有限公司)，手术显微镜(德国Leica)，BCA 蛋白测定试剂盒、PVDF 膜及化学发光试剂(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 晶状体分离及培养 清洁级健康雄性4 周龄Sprague-Dawley 大 鼠40 只，体质量(160±20) g，购自哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物研究中心。脱臼后，在解剖显微镜下无菌操作取两只眼睛，用生理盐水、青霉素(80 万U/500 mL)和庆大霉素(8 万U/500 mL)冲洗3 次后，在显微镜下分离晶状体组织，置入含有1.5 mL M199 的24 孔培养板中，每孔1 只晶状体。

1.2.2 实验分组 按照随机数字法将晶状体分为4组，每组20 只晶状体。空白对照组：单纯M199 培养基培养；七叶皂苷钠组：M199 培养基内七叶皂苷钠浓度为0.2 g/L；氧化损伤组：培养基内H2O2浓度为1 mmol/L；氧化损伤+七叶皂苷钠组：培养基内H2O2浓度为1 mmol/L，七叶皂苷钠浓度为0.2 g/L，分别培养6 h、12 h、24 h 后取相应时间点晶状体观察并实验。

1.3 观察指标

1.3.1 晶状体透明度观察记录方法 取上述各时间点的各组晶状体观察透明度。在白色背景下设计粗细一致的十字交叉黑色线条，将被检晶状体置于十字交叉处，以透过晶状体所能看到的清晰度予以分级。“-”：晶状体透明，线条清晰可见；“+”：线条增粗，模糊，但是完全可见；“++”：仅晶状体中央部隐约可见线条轮廓；对“+”的数量行统计学处理。

1.3.2 HE 染色 晶状体观察透明度后，每组随机取10 只晶状体迅速浸入新鲜配制的多聚甲醛（40 g/L）中固定40 min，制备石蜡切片，用苏木素染色5 min，蒸馏水洗涤，去玻片的浮色，置于1%盐酸乙醇中浸泡10 s 后伊红染色5 min，再用蒸馏水洗涤以除去浮色。

1.3.3 透射电镜2.5%戊二醛溶液固定晶状体24 h，醋酸铀染液染色，丙酮脱水，常规电镜包埋，制作超薄切片，枸橼酸铅和2%醋酸双氧铀染色，透射电镜观察（×10000）。

1.3.4 GSH 含量及CAT 活力测定 取适量晶状体组织制成匀浆，3000 r/min 离心15 min，去上清液置于EP 管内，按照试剂盒说明，采用ELISA 法测定GSH含量及CAT 活力。

1.3.5 Western blot 检测 将每组剩余的10 只晶状体以RIPA 裂解液提取总蛋白后，用BCA 蛋白质测定试剂盒测定浓度，电泳分离蛋白及转膜后分别加入一抗、二抗，采用增强化学发光法曝光显影并扫描灰度。

1.4 统计学方法

采用SPSS16.0 统计学软件对实验数据进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组晶状体透明度情况

空白对照组及七叶皂苷钠组透过晶状体可以清晰看到下方的十字线，氧化损伤组晶状体透明度明显下降，晶状体下方的十字线变得模糊。与空白对照组比较，氧化损伤组在6 h（χ2=4.970，P=0.043），12 h（χ2=7.619，P=0.006）及24 h（χ2=5.714，P=0.017）时间点上均有统计学意义（P＜0.05）；与七叶皂苷钠组比较，氧化损伤组在6 h（χ2=4.803，P=0.028），12 h（χ2=6.144，P=0.013）及24 h（χ2=4.444，P=0.035）时间点上也均有统计学意义（P＜0.05）；而氧化损伤+七叶皂苷钠组晶状体混浊情况明显轻于氧化损伤组，与氧化损伤组比较，12 h （χ2=4.800，P=0.028） 及24 h（χ2=4.444，P=0.035）时间点上差异均有统计学意义（P＜0.05）（图1，表1）。

表1 各组晶状体混浊数量比较（n=20）

2.2 HE 染色情况

空白对照组及七叶皂苷钠组晶状体上皮细胞为单层立方形细胞，排列整齐。而氧化损伤组晶状体边缘不规则，晶状体上皮细胞大小不一，细胞排列紊乱，近赤道部尤其明显，给予七叶皂苷钠干预后，细胞形态逐渐规则（图2）。

2.3 电镜观察大鼠晶状体

透射电镜观察显示，空白对照组及七叶皂苷钠组大鼠晶状体上皮细胞胞膜结构完整，细胞核膜连续，染色质均匀，核仁结构清晰；氧化损伤组晶状体上皮细胞基质密度减低，胞质内空泡形成，细胞核肿胀，染色质稀疏；给予七叶皂苷钠干预后，细胞形态逐渐改善，细胞内仍可见线粒体空泡样改变，细胞核形态略规整（图3）。

图1 各组晶状体透明度观察。1A 空白对照组；1B 七叶皂苷钠组；1C 氧化损伤组；1D 氧化损伤+七叶皂苷钠组

图2 HE 染色观察近赤道部大鼠晶状体前膜囊及晶状体上皮细胞(×40)。2A 空白对照组；2B 七叶皂苷钠组；2C 氧化损伤组；2D 氧化损伤+七叶皂苷钠组

图3 透射电镜观察大鼠晶状体（×10000）。3A 空白对照组；3B 七叶皂苷钠组；3C 氧化损伤组；3D 氧化损伤+七叶皂苷钠组。△核膜；* 染色质；# 空泡

2.4 晶状体组织中GSH 含量及CAT 活力变化

GSH 含量：氧化损伤组与空白对照组比较，t=12.024，P=0.000；与七叶皂苷钠组比较，t=15.240，P=0.000；与氧化损伤+七叶皂苷钠组比较，t=5.573，P=0.005，均有统计学意义。

CAT 活力：氧化损伤组与空白对照组比较，t=9.461，P=0.000；与七叶皂苷钠组比较，t=9.482，P=0.000；与氧化损伤+七叶皂苷钠组比较，t=4.118，P=0.015，均有统计学意义（表2）。

表2 晶状体组织GSH 含量、CAT 活力及NF-κB 蛋白相对表达量变化

2.5 Western-blot 检测晶状体上皮细胞内NF-κB 表达的影响

氧化损伤组大鼠晶状体中NF-κB 的蛋白表达量显著高于空白对照组及七叶皂苷钠组（t空白=5.175，P空白=0.007；t七叶皂苷=3.924，P七叶皂苷=0.017）；氧化损伤+七叶皂苷钠组大鼠晶状体中NF-κB 的蛋白表达量降低，与氧化损伤组比较差异有统计学意义（t=3.571，P=0.023）（表2，图4）。

3 讨论

图4 Western-blot 检测晶状体上皮细胞内NF-κB 蛋白表达。NFκB：核因子κB；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

氧化应激参与人体许多衰老疾病的发生，如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、心肌梗塞、帕金森病等，另外，许多视力损害和致盲疾病也与氧化应激有关，如青光眼、白内障、视网膜病变等[3-4]。其中，白内障的发生率在致盲性眼病中最高，有效的防治药物仍然是最理想的治疗选择。国内外已有许多实验和流行病学研究建议可以通过使用抗氧化剂和某些代谢受体激动剂延缓白内障的发生[5-6]。

七叶皂苷钠主要成分为三萜皂苷，临床上多用于缺血性脑病及脑水肿的治疗[7-8]。近年来，逐渐有学者将七叶皂苷钠引入到眼科疾病的治疗中[9-10]。本课题旨在探讨七叶皂苷钠在氧自由基导致的晶状体上皮细胞凋亡中的作用，从而进一步拓宽七叶皂苷钠的临床应用。

为了研究白内障病变的发生机理并探索出更多的治疗性药物，国内外学者尝试了大量方法诱导晶状体组织凋亡，例如：化学药物、紫外线照射、H2O2等[11-12]。本实验中，我们参考既往学者制备过氧化氢诱导鼠白内障方法，建立大鼠白内障模型，观查七叶皂苷钠对晶状体上皮细胞的保护作用[2，13]。晶状体形态学观察结果显示，氧化损伤组晶状体透明度明显下降，七叶皂苷钠作用后，晶状体透明度提高，表明七叶皂苷钠的干预对维持晶状体透明度有保护作用。此外，HE 染色显示氧化损伤组晶状体囊皱缩，晶状体上皮细胞紊乱，这可能是由于H2O2刺激后影响了晶状体内离子通道的正常功能，晶状体的代谢及防御功能出现紊乱，导致晶状体前囊膜受损，从而诱导了晶状体的混浊。

晶状体组织氧化损伤后会产生一系列的病理改变，产生大量自由基，自由基通过信号转导途径引发脂质过氧化连锁反应，从而导致GSH 及CAT 等抗氧化酶清除自由基的能力降低，导致晶状体混浊进一步加重。本研究结果显示，氧化损伤组GSH 含量和CAT 活力明显低于空白对照组及七叶皂苷钠组，说明氧化损伤组晶状体组织氧化损伤程度较重，七叶皂苷钠处理后GSH 含量和CAT 活力均升高，表明七叶皂苷钠具有抑制脂质过氧化连锁反应的能力，进一步抑制了晶状体损伤的发生。

NF-κB 属肿瘤坏死因子受体超家族的一员，参与炎症反应和免疫应答反应，可以对有害细胞的刺激做出反应，许多分子都受NF-κB 的调控[14]。我们的研究结果显示，高浓度H2O2诱导了晶状体上皮细胞内NF-κB 水平升高，七叶皂苷钠有效降低NF-κB 表达水平，进一步证实七叶皂苷钠可抑制氧化损伤诱导的晶状体上皮细胞凋亡。

七叶皂苷钠的细胞毒性被公认为低于化学合成药物，被广泛用于多种全身疾病的治疗，鉴于其临床应用的有效性及安全性，我们考虑，七叶皂苷钠有望成为治疗白内障的有效药物，为该病的临床治疗提供新思路。