LncRNA NR2F2-AS1靶向抑制miR-129-5p调控胶质瘤细胞增殖和凋亡的机制研究

2020-06-19张大鹏杨艳辉

中国医药生物技术 2020年3期

关键词：可抑制荧光素酶胶质瘤

张大鹏，杨艳辉

·论著·

LncRNA NR2F2-AS1靶向抑制miR-129-5p调控胶质瘤细胞增殖和凋亡的机制研究

张大鹏，杨艳辉

453000 河南，新乡市中心医院神经外科（张大鹏）；453600 河南，辉县市人民医院超声科（杨艳辉）

研究 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在胶质瘤中的表达及其对胶质瘤 U251 细胞增殖和凋亡的影响。

qRT-PCR 检测 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在胶质瘤组织和细胞中表达水平，MTT 法和流式细胞术检测 U251 细胞增殖和凋亡，Western blot 检测细胞中CyclinD1、p21、Bax 和 Bcl-2 的蛋白表达水平，双荧光素酶报告系统验证 NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 的调控关系。

与正常脑组织相比，在胶质瘤组织中 lncRNA NR2F2-AS1 的含量显著升高（< 0.05），miR-129-5p 的含量则显著下降（< 0.05）；干扰 NR2F2-AS1 表达和过表达 miR-129-5p 均可抑制胶质瘤 U251 细胞增殖并促进细胞凋亡，使细胞中 CyclinD1 和 Bcl-2 含量降低（< 0.05），p21 和 Bax 含量升高（< 0.05）；lncRNA NR2F2-AS1 靶向负调控 miR-129-5p 的表达；抑制 miR-129-5p 表达逆转了干扰 NR2F2-AS1 表达对 U251 细胞增殖、凋亡的作用。

干扰 lncRNA NR2F2-AS1 通过靶向促进 miR-129-5p表达抑制胶质瘤 U251 细胞增殖，诱导细胞凋亡。LncRNA NR2F2-AS1 可能是胶质瘤的分子靶点。

胶质瘤； U251 细胞； NR2F2-AS1； miR-129-5p；增殖；凋亡

胶质瘤是常见的原发性恶性脑肿瘤，主要治疗手段是手术和放化疗，但治疗效果差，患者生存期短，预后较差[1]。研究抑制胶质瘤的分子机制，寻找潜在的个性化精准治疗靶点，已成为胶质瘤基础研究领域的热点。

研究表明，长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可能通过参与信号通路调控机制与microRNA（miRNA）相互作用，影响胶质瘤的生长和进展[2]。研究表明，核受体亚家族 2 组 F 成员 2 反义 RNA1（nuclear receptor subfamily 2 group F member 2-antisense RNA 1，NR2F2-AS1）在前列腺癌[3]、结直肠癌[4]、非小细胞肺癌[5]组织中表达上调，与癌细胞的增殖和凋亡有关，但其在胶质瘤中的作用尚不清楚。本研究通过 LncBase 预测发现，miR-129-5p 可能是NR2F2-AS1 的靶基因。miR-129-5p 在胶质瘤组织和细胞中表达下调，过表达 miR-129-5p 抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡[6]。miR-129-5p 和NR2F2-AS1 在胶质瘤中是否存在某种调控关系，尚不清楚。

本课题以胶质瘤 U251 细胞为主要研究对象，研究 NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 对U251 增殖、凋亡的影响及潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

2016 年 6 月– 2017 年 6 月于本院病理检查确诊为胶质瘤的患者 20 例，其中男 12 例，女8 例，年龄 21 ~ 65（43.2 ± 14.8）岁，胶质瘤分级：I 级 2 例，II 级 5 例，III 级 8 例，IV 级 5 例。留取 20 例患者手术切除的胶质瘤组织，同时选择 20 例志愿者（脑外伤行颅内减压手术患者）正常脑组织作为对照。所有患者术前未接受放疗和化疗。本研究通过医院医学伦理委员会批准，并与所有患者或其家属、志愿者签订知情同意书。

人胶质母细胞瘤细胞株 U251 购自美国 ATCC；高糖 DMEM 培养基和胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco 公司；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自美国 Sigma-Aldrich 公司；Trizol 试剂、Real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒（RT-PCR）和 Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；流式细胞仪和流式试剂盒购自美国 BD 公司；NR2F2-AS1 干扰剂（si-NR2F2-AS1）、NR2F2-AS1 过表达载体（pcDNA-NR2F2-AS1）、miR-129-5p 模拟物（miR- 129-5p）、miR-129-5p 抑制剂（anti-miR-129-5p）、阴性对照（si-NC、miR-NC、pcDNA、anti-miR-NC）、NR2F2-AS1 野生型和突变型双荧光素酶报告载体均购自上海吉玛制药技术有限公司；CyclinD1 抗体、p21 抗体、Bax 抗体、Bcl-2 抗体和 GAPDH 抗体购自美国 Santa Cruze 公司；双荧光素酶报告系统购自美国 Promega 公司；全自动酶标仪及 Real-time PCR 仪购自美国 Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将 U251 细胞用含10% FBS、1% 青-链霉素的高糖 DMEM 培养液培养，然后将培养瓶置于37 ℃ 5% CO2培养箱中，湿度 95%。待细胞生长至对数生长期时，洗涤消化，1:3 传代。

1.2.2 细胞转染收集对数生长期的 U251 细胞，以2 × 105个/孔接种于 6 孔板中，细胞培养至融合为一层时进行转染。用 Lipofectamine 2000 将si-NC、si-NR2F2-AS1、miR-NC、miR-129-5p、pcDNA、pcDNA-NR2F2-AS1、si-NR2F2-AS1 + anti-miR-NC、si-NR2F2-AS1 + anti-miR-129-5p、WT-NR2F2-AS1 + miR-NC、WT-NR2F2-AS1 + miR-129-5p、MUT-NR2F2-AS1 + miR-NC 和 MUT-NR2F2-AS1 + miR-129-5p 转染入培养好的 U251 细胞中，培养 4 h，换成完全培养基，转染48 h，收集细胞。

1.2.3 Real-time PCR 检测 RNA 的表达收集胶质瘤组织和正常脑组织样本及各组转染后的 U251 细胞，提取组织样本和细胞总 RNA，然后反转录合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 Real-time PCR 反应合成 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p，反应程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s、59 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。引物如下：miR-129-5p 上游：5' GGGGGCTTTTT GCGGTCTGG 3'，下游：5' AGTGCGTGTCGGAG TC 3'；NR2F2-AS1 上游：5' CTCTGGGAATCGTCC TGTATGC 3'，下游：5' TGGTTTCCTGGTTCTCTG CC 3'。用 2−ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.4 MTT 实验测定细胞活性收集转染后的U251 细胞，以 2 × 103个/孔接种于96 微孔板中，置培养箱继续培养，分别在 24、48、72 h 时进行 MTT 实验，每孔加入 5 mg/ml 的 MTT 20 μl，培养 4 h，弃上清，加入 DMSO 150 μl/孔，室温振荡 10 min，酶标仪测定 490 nm 吸光度值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率将培养至对数生长期的各组转染后的 U251 细胞接种于 6 孔板中，继续培养 48 h，收集细胞，洗涤 2 次，根据凋亡试剂盒说明书操作，用 400 μl 标记缓冲液重悬细胞，加入 5 μl Annexin V-FITC 和 10 μl 碘化丙啶（PI），室温避光 20 min，用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.6 双荧光素酶报告系统实验根据 1.2.2 进行 U251 细胞的培养和转染，将构建的 lncRNA NR2F2-AS1 的野生型（WT-NR2F2-AS1）和突变型（MUT-NR2F2-AS1）双荧光素酶报告载体，分别与 miR-NC 或 miR-129-5p 共转染 U251 细胞，转染 48 h，收集细胞，裂解细胞，离心收集上清，检测上清中荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在胶质瘤组织中的表达

与正常脑组织相比，在胶质瘤组织中 lncRNA NR2F2-AS1 的含量显著升高（< 0.05），miR-129-5p 的含量则显著下降（< 0.05），见表 1。

表 1 lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p在胶质瘤组织中的表达（，n = 20）

注：与正常脑组织组比较，*< 0.05。

Note:*0.05 vs normal brain tissue.

2.2 干扰 lncRNA NR2F2-AS1 表达可抑制胶质瘤 U251 细胞增殖

干扰 NR2F2-AS1 表达后，胶质瘤 U251 细胞中 lncRNA NR2F2-AS1 含量显著下降（< 0.05），细胞490在 24、48 和 72 h 均显著下降（< 0.05），CyclinD1 表达降低（< 0.05），p21 表达升高（< 0.05），见图 1 和表 2。说明干扰 NR2F2-AS1 表达可以抑制胶质瘤 U251 细胞增殖。

2.3 干扰 lncRNA NR2F2-AS1 表达可诱导胶质瘤 U251 细胞凋亡

干扰 lncRNA NR2F2-AS1 表达后，U251 细胞凋亡率显著增加（< 0.05），细胞中Bax 含量升高（< 0.05），Bcl-2 表达降低（< 0.05），见图 2 和表 3。说明干扰 NR2F2-AS1 表达可诱导 U251 细胞凋亡。

2.4 miR-129-5p 过表达可抑制胶质瘤 U251 细胞增殖、诱导细胞凋亡

过表达 miR-129-5p 后，U251 细胞中 miR-129-5p 含量显著升高（< 0.05），细胞490在 48 h 和 72 h 时显著下降（< 0.05），细胞凋亡率升高（< 0.05），CyclinD1和 Bcl-2 含量降低（< 0.05），p21 和 Bax 含量升高（< 0.05），见图 3 和表 4。说明过表达 miR-129-5p 可抑制 U251 细胞增殖，促进细胞凋亡。

图 1 增殖相关蛋白表达

Figure 1 Expression of proteins related to proliferation

表 2 干扰 lncRNA NR2F2-AS1 表达对胶质瘤 U251 细胞增殖的影响（，n = 9）

注：与si-NC 组比较，*< 0.05。

Note:*< 0.05 vs si-NC group.

图 2 干扰 lncRNA NR2F2-AS1 表达对胶质瘤 U251 细胞凋亡的影响（A：凋亡相关蛋白表达；B：细胞凋亡流式图）

Figure 2 Effect of interfering the expression of NR2F2-AS1 on apoptosis of glioma U251 (A: Expression of apoptosis-related proteins; B: Flow charts of apoptosis)

表 3 干扰 lncRNA NR2F2-AS1 表达对胶质瘤 U251 细胞凋亡的影响（，n = 9）

注：与 si-NC 组比较，*< 0.05。

Note:*< 0.05vssi-NC group.

图 3 miR-129-5p 过表达对胶质瘤 U251 细胞增殖和凋亡的影响（A：增殖、凋亡相关蛋白表达；B：细胞凋亡流式图）

Figure 3 Effects of miR-129-5p over-expression on proliferation and apoptosis of glioma U251 cells (A: Expression of proteins related to proliferation and apoptosis; B: Flow charts of apoptosis)

表 4 过表达 miR-129-5p 对胶质瘤 U251 细胞增殖和凋亡的影响（，n = 9）

注：与 miR-NC 组比较，*< 0.05。

Note:*0.05vsmiR-NC group.

2.5 lncRNA NR2F2-AS1 靶向调控 miR-129-5p 的表达

LncBase 预测结果显示，lncRNA NR2F2-AS1的序列中含有与 miR-129-5p 互补的序列，见图 4。双荧光素酶报告实验结果显示，过表达miR-129-5p 组野生型 WT-NR2F2-AS1 的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降（0.05），而突变型 MUT-NR2F2-AS1 的萤火虫荧光素酶相对活性无明显变化，见表 5。qRT-PCR 结果发现，过表达 NR2F2-AS1 可显著下调 miR-129-5p 含量（< 0.05）；干扰 NR2F2-AS1 表达显著上调 miR-129-5p 表达量（< 0.05），见表 6。说明 lncRNA NR2F2-AS1 靶向负调控 miR-129-5p 的表达。

图 4 NR2F2-AS1 的序列中含有与 miR-129-5p 互补的核苷酸序列

Figure 4 NR2F2-AS1 contains nucleotide sequences complementary to miR-129-5p

表 5 双荧光素酶报告实验（，n = 9）

注：与 miR-NC 组比较，*< 0.05。

Note:*< 0.05vsmiR-NC group.

表 6 NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 在胶质瘤U251 细胞中的调控关系（，n = 9）

注：与 pcDNA 组比较，#0.05；与 si-NC 组比较，&0.05。

Note:#< 0.05vspcDNA group;&< 0.05vssi-NC group.

2.6 抑制 miR-129-5p 表达逆转了干扰 NR2F2-AS1 表达对胶质瘤 U251 细胞增殖和凋亡的作用

为确认 lncRNA NR2F2-AS1 通过调控 miR-129-5p 发挥对 U251 细胞的增殖和凋亡的影响作用，在干扰 NR2F2-AS1 的同时抑制 miR-129-5p 转录。结果表明，干扰NR2F2-AS1 同时抑制 miR-129-5p 转录后，U251 细胞中miR-129-5p 水平下降（< 0.05），细胞在 24、48 和 72 h 时细胞490显著升高（< 0.05），细胞凋亡率降低（< 0.05），CyclinD1 和 Bcl-2 含量升高（< 0.05），p21 和 Bax 含量下降（< 0.05），见图 5 和表 7。说明抑制 miR-129-5p 表达逆转了干扰 NR2F2-AS1 表达对 U251 细胞增殖、凋亡的作用。

3 讨论

大量研究表明，lncRNA 在恶性胶质瘤组织和细胞系异常表达，可能对胶质瘤的发生、发展等恶性表型具有重要意义[7]。LncRNA NR2F2-AS1 又称核受体亚家族 2 组 F 成员 2反义 RNA1，其在多种肿瘤组织中表达异常[3-5]，下调其表达可抑制癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。NR2F2-AS1 在卵巢癌组织中表达下调，I ~ II 期卵巢癌组织中的表达水平明显低于 III ~ IV 期，与患者的病理分期有关[8]。LncRNA NR2F2-AS1 在胶质瘤中表达和作用尚不清楚。本研究通过检测 20 例胶质瘤组织和正常脑组织发现，与正常脑组织相比，在胶质瘤组织中NR2F2-AS1 的表达量显著升高，干扰 NR2F2-AS1 表达可以抑制胶质瘤 U251 细胞增殖，诱导 U251 细胞凋亡，说明在胶质瘤中 lncRNA NR2F2-AS1 具有重要作用。

图 5 抑制 miR-129-5p 表达逆转了干扰 lncRNA NR2F2-AS1 表达对胶质瘤 U251 细胞增殖和凋亡的作用（A：增殖、凋亡相关蛋白表达；B：细胞凋亡流式图）

Figure 5 Inhibition of miR-129-5p reversed the effects of interfering NR2F2-AS1 on the proliferation and apoptosis in glioma U251 cells (A: Expression of proteins related to proliferation and apoptosis; B: Flow charts of apoptosis)

分组GroupsmiR-129-5pOD490凋亡率（%）Apoptosis rate (%)CyclinD1 蛋白CyclinD1 proteinp21 蛋白p21 proteinBcl-2 蛋白Bcl-2 proteinBax 蛋白Bax protein 24 h48 h72 h si-NC1.01 ± 0.080.36 ± 0.030.68 ± 0.060.97 ± 0.096.87 ± 0.690.66 ± 0.060.30 ± 0.030.72 ± 0.070.21 ± 0.03 si-NR2F2-AS12.51 ± 0.25*0.32 ± 0.03*0.41 ± 0.04*0.57 ± 0.05*20.65 ± 2.14*0.27 ± 0.03*0.76 ± 0.06*0.31 ± 0.03*0.63 ± 0.05* si-NR2F2-AS1 +anti-miR-NC2.54 ± 0.240.31 ± 0.030.38 ± 0.030.54 ± 0.0521.48 ± 2.210.26 ± 0.030.77 ± 0.070.28 ± 0.030.62 ± 0.06 si-NR2F2-AS1 +anti-miR-129-5p1.43 ± 0.14#0.35 ± 0.04#0.61 ± 0.05#0.84 ± 0.07#12.79 ± 1.34#0.54 ± 0.05#0.42 ± 0.04#0.61 ± 0.06#0.33 ± 0.03# F147.1604.74491.25587.600147.341181.481186.845167.068202.443 P 0.0000.007 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

注：与 si-NC 组比较，*0.05；与 si-NR2F2-AS1 + anti-miR-NC 组比较，#0.05。

Note:*0.05vssi-NC group;#0.05vssi-NR2F2-AS1 + anti-miR-NC group.

本研究通过 LncBase 预测发现，NR2F2-AS1 的序列中含有与 miR-129-5p 互补的核苷酸序列，预示 NR2F2-AS1 与 miR-129-5p 之间可能存在结合位点或调控关系。miR-129-5p是 miR-129 的主要功能型成熟产物，参与调控多种肿瘤的增殖、凋亡、侵袭迁移等生物学过程，并在炎症反应、血管再生和神经发育等过程中起调控作用[9]。miR-129-5p 在非小细胞肺癌[10]、前列腺癌[11]、胰腺癌[12]、胃癌[13]、乳腺癌[14]等肿瘤组织和细胞中低表达，过表达 miR-129-5p 可抑制肿瘤增殖、迁移、侵袭和促进细胞凋亡。miR-129-5p 在多形性胶质母细胞瘤（GBM）中表达下调，通过靶向 Wnt5a 阻断 PKC/ERK/NF-κB 和 JNK 通路抑制 GBM 细胞增殖、侵袭、迁移、血管生成、神经球形成和阻断对替莫唑胺的抵抗[15]。miR-129-5p 在胶质瘤中低表达，与胶质瘤分级呈负相关，过表达 miR-129-5p 可靶向 DNMT3A 抑制细胞的增殖，阻滞 G1 期细胞周期[16]；miR-129-5p 还可靶向 FNDC3B 抑制 GBM 细胞活性、增殖、迁移和侵袭等细胞过程[17]。本研究结果表明，与正常脑组织相比，miR-129-5p 在胶质瘤组织中水平下降，过表达 miR-129-5p 可抑制胶质瘤 U251 细胞增殖，促进细胞凋亡，与前述研究结论[15-17]一致。

双荧光素酶报告系统和 qRT-PCR 结果表明，lncRNA NR2F2-AS1 靶向负调控miR-129-5p 的表达，进一步研究发现，抑制 miR-129-5p 表达逆转了干扰 NR2F2-AS1 表达对 U251 细胞增殖、凋亡的作用，说明两者在胶质瘤细胞中具有调控关系。

综上，本研究阐述了在胶质瘤组织中，lncRNA NR2F2-AS1 上调，miR-129-5p 下调；lncRNA NR2F2-AS1 在胶质瘤 U251 细胞中靶向 miR-129-5p 调控 U251 细胞增殖和凋亡，lncRNA NR2F2-AS1 和 miR-129-5p 是胶质瘤的潜在分子靶点，对胶质瘤的基础和临床研究具有重要意义。

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LncRNA NR2F2-AS1 regulates proliferation and apoptosis of the glioma cells by targeting miR-129-5p

ZHANG Da-peng, YANG Yan-hui

Department of Neurosurgery, Xinxiang Central Hospital, Henan 453000, China (ZHANG Da-peng); Department of Ultrasound, Huixian People′s Hospital, Henan 453600, China (YANG Yan-hui)

To investigate the expression of lncRNA NR2F2-AS1 and miR-129-5p in gliomas and their effects on the proliferation and apoptosis of U251 cells.

Expression levels of lncRNA NR2F2-AS1 and miR-129-5p were measured by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The proliferation and apoptosis of U251 cells were determined by MTT assay and flow cytometry, respectively. Expression of CyclinD1, p21, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. Dual-luciferase reporting assay system was performed to confirm the targeted relationship between lncRNA NR2F2-AS1 and miR-129-5p.

Compared with normal brain tissue, the level of lncRNA NR2F2-AS1 in glioma tissues was increased significantly (< 0.05), and the level of miR-129-5p was decreased remarkably (< 0.05). Interfering with the expression of NR2F2-AS1 and over-expression of miR-129-5p inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of glioma U251 cells, and reduced the expression levels of CyclinD1 and Bcl-2 in the cells (< 0.05), while increased the content of p21 and Bax (< 0.05). LncRNA NR2F2-AS1 targets and negatively regulates the expression of miR-129-5p. Inhibition of miR-129-5p reversed the effects of interfering NR2F2-AS1 on the proliferation and apoptosis of U251 cells.

Interfering lncRNA NR2F2-AS1 inhibits the proliferation and induces apoptosis of glioma U251 cells by targeting and promoting the expression of miR-129-5p. LncRNA NR2F2-AS1 may be a molecular target of glioma.

Glioma; U251 cells; NR2F2-AS1; miR-129-5p; Proliferation; Apoptosis

·协会之窗·

两家会员单位通过牛血清生产质量达标自律检查

经过材料审核，牛血清产品质量控制检查组的现场检查与中国食品药品检定研究院三批次样品抽检，协会两家会员单位通过牛血清生产质量达标自律检查。

通过单位公示如下：

1．兰州民海生物工程有限公司

证书编号：2019N001

证书有效期：2019 年 10 月– 2024 年 9 月

2．内蒙古维克生生物技术股份有限公司

证书编号：2020N001

证书有效期：2020 年 1 月– 2024 年 12 月

ZHANG Da-peng, Email: zhangyanjiao695@126.com