高效液相色谱法测定复方丹参方中4种成分研究

刘丹丹（福建中医药大学附属漳州市中医院 漳州 363000）

复方丹参方是传统中医中最为经典、常用的活血化瘀、理气止痛方剂，是心血管疾病治疗常用药物，由丹参、三七及冰片构成[1]。近年来，关于复方丹参方的药效和活性成分的研究越来越多，通常是以方中的丹参或者三七单个作为成分研究的对象，很少将两者主要活性成分在同个指纹图谱中体现。笔者基于既往研究，建立HPLC法于同一色谱条件下便捷、迅速检测出复方丹参方内丹参中4种主要活性成分，以期为该药物的药效和质量评定提供依据，现报道如下。

1 试药及仪器

1.1 试药：复方丹参片（广州白云山制药股份有限公司，国药准字Z44023372，批号20180912）；对照品包括三七皂苷R1（含量95%）、人参皂苷 Rg1（含量 92%）、丹参酮 IIA（含量 99%）、丹酚酸B（含量94%），均用于含量测定。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、盐酸作为分析纯，水为怡宝纯净水。

1.2 仪器：选用美国安捷伦科技公司生产的Agilent 1100型高效液相色谱仪及配套色谱工作站；北京赛多利斯公司生产的MS205DU型电子天平（感量0.1 mg）；上海必能信公司生产的SB2200型超声波清洗机（50 Hz）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液制备：精密测定复方丹参片20片，研磨成粉末状，精密称取300 mg，置入锥形瓶，再称取70%甲醇20 mL加入，然后超声提取30 min，静置变冷，称总量，用70%甲醇补充减少的量，摇匀，再缓缓过滤，取续滤液，溶液需超过孔径0.45 μm 滤膜，即得。

2.1.2 对照品溶液制备：分别精密量取丹酚酸B（60 μg/mL）、人参皂苷 Rg1（10.2 mg/mL）、三七皂苷 R1（1.05 mg/mL）及丹参酮ⅡA（40 μg/mL）为对照品，加甲醇制成混标溶液和单标溶液。

2.2 色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC C18；流动相为0.02%磷酸（A）和含0.02%磷酸的80%乙腈（B）；梯度洗脱，柱温控制在40℃；流速设为0.42 mL/min；检测波长设为203 nm；流动相梯度为 0～0.8 min，90%（A）～80%（B），4～10 min 75%（A）～25%（B），10 min95%（B）[2]。

2.3 流动相及检测波长选择：本项研究中，检测波长为203 nm，甲醇的短波长度会吸收紫外线，这会影响皂苷的色谱峰测定。因此，甲醇不能用作流动相。样品中含有酚酸，所以在流动相中加入酸溶液以避免酚酸类物质水解，而甲酸或者乙酸在低波长下会吸收紫外线，选定流动相为乙腈-0.1%磷酸梯度本研究中的洗脱。

通过对三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、丹参酮IIA的紫外线检测，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在203 nm低波长处出峰；丹酚酸B在281 nm处最大吸收；丹参酮IIA于270 nm处最大吸收。

按照色谱条件测定样品溶液内的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、丹参酮IIA含量，显示4种成分和相邻成分分离度良好，如图1。

2.4 方法考察

2.4.1 线性分析：吸取混合对照品溶液用0.45 μm孔径的滤膜滤过，于本研究色谱条件下分别进样 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL 及 40 μL，记录色谱峰面积。横坐标为浓度（X），纵坐标峰为面积（Y），绘制标准曲线图，再行线性回归分析，4种成分标准曲线方程、线性范围以及相关系数[3]。见表1。

表1 复方丹参方中的4种活性成分的线性关系

2.4.2 重复性试验：取复方丹参片按样品制备法分别平行制备4份样品溶液，依照既定实验色谱条件测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、丹酚酸B、丹参酮IIA平均含量。见表2。

表2 HPLC检测复方丹参方中4种活性成分的重复性

2.4.3 稳定性试验：取复方丹参片样品溶液，按照本研究色谱条件，分别在 0、2、4、6、8 h 测定、记录色谱图，计算出丹酚酸 B、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹参酮IIA的峰面积的RSD。结果显示各成分含量依次是0.93%、0.33%、0.68%、0.93%、0.87%，该溶液在避光密闭容器中保存8 h内的含量变化不大，相对稳定。

2.4.4 精密度试验：取混合对照品制成高、中、低浓度质控品，按“2.3”项下操作处理，每一浓度连续进样5次，通过标准曲线算出含量，并算日内精密度。见表3。

表3 UPLC检测复方丹参方中4种活性成分的精密度

2.4.5 回收率实验：精密称取复方丹参片0.5 g，置于50 mL量瓶，超声振荡，平行3组，精密加入高、中、低剂量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、丹酚酸B及丹参酮ⅡA对照品，按“2.2”项下色谱条件测定，计算4种成分回收率。见表4。

表4 HPLC检测复方丹参方中4种活性成分的回收结果

3 讨论

中药复方是由辨证论治后，选择适当、合理剂量的药物，严格按照组成原则进行配伍组合制成的组合药剂。这种处方中所含有效活性成分多样且复杂，准确有效选择控制指标是研究难点。本研究基于《中国药典》及研究文献，丹参含有丰富水溶性成分与脂溶性成分，选择水溶性成分中的丹酚酸B与脂溶性成分中的丹参酮IIA用作指示性指标。三七的主要成分为皂苷，最终选取三七人参皂苷R1、人参皂苷Rg1作为指标成分，选定的指标成分不但有代表性，而且有着良好科学性和客观性。

在相同波长下检测含发色团与辅助色团等4种活性成分，先要对本研究结果中的成分进行全波长扫描，具体表现为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1在203 nm低波长处出峰，丹酚酸B在281 nm处最大吸收；丹参酮IIA于270 nm处最大吸收，这是因为发色团与辅助色团中的三种皂苷较少，单单在低波长下可以检测到，原因在于波长203 nm处会有末端吸收，通过连续调整流动相比例，使检测活性成分吸收峰和末端吸收峰分离度高于1.5，最后以末端吸收203 nm作为色谱条件。同时，使用HPLC测定活性成分，并在10 min内清晰显示色谱图，分析所需时间更少，分离度更高，可提高检测效率，节省人力、物力[4-8]。其次，参考《中国药典》等文献，通过调整流动相比例，比较流动相是0.02%磷酸水和含0.02%磷酸80%的甲醇-水、水-乙腈、醋酸水-乙腈时所得色谱图，最终选择乙腈作为流动相进行成分检测。从本研究结果看，采用HPLC法测定复方丹参方中丹酚酸B、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹参酮IIA浓度和峰面积均有良好线性关系（r＞0.97）；同时，丹酚酸 B、人参皂苷 Rg1、三七皂苷R1及丹参酮IIA的平均提取回收率分别是99.42%、96.99%、97.04%、97.13%，精密度RSD均＜3.0%，且有着良好重复性、稳定性，能满足测定要求。

综上所述，对临床广泛应用的复方丹参方剂内4种常见活性成分进行测定，是对药物质量控制和管理的拓展和补充。HPLC测定复方丹参方中的丹酚酸B、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1及丹参酮IIA等活性成分有重要价值，且有高精密度、重复性及稳定性。