成熟时间对燕麦羊肉香肠食用品质、脂质氧化及风味物质积累的影响

2020-06-15王德宝马文淑王柏辉张俊英康连和王莉梅张园园乔建敏李星云王晓冬郭天龙

食品与发酵工业 2020年11期

王德宝，马文淑，王柏辉，张俊英，康连和，王莉梅，张园园，乔建敏，李星云，王晓冬，郭天龙*

1(内蒙古农牧业科学院，内蒙古呼和浩特，010031) 2(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特，010031) 3(鄂尔多斯市食品检验检测中心，内蒙古鄂尔多斯，017000) 4(内蒙古鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古鄂尔多斯，017010)

发酵香肠是指将绞碎的瘦肉与丁状脂肪及辅料混匀、腌制后灌入肠衣，经自然或添加外源发酵剂发酵成熟而制成一类pH值较低、色泽诱人、风味独特、保藏时间长的发酵肉制品[1-2]。适宜发酵温度和环境湿度下，微生物发酵剂快速繁殖、分解糖类生成乳酸、乙酸等有机酸[3]，促使香肠pH值迅速降低到安全pH 5.3以下。随着环境温度、湿度下降及酸度降低，肌球重链蛋白结合水分能力逐渐减弱[4]，促使香肠在成熟过程中水分快速蒸发，成品水分活度aw低于0.85，低酸度及水分活度抑制香肠中大肠菌群等腐败、致病菌生长繁殖并降低其数量，提高香肠成品卫生和安全质量[5]。发酵成熟过程中发酵剂分泌蛋白酶及脂酶，将蛋白、脂质分解为小分子游离氨基酸和脂肪酸，既为人体易吸收的营养素，也为香肠风味形成提供重要前体物质[4,6]。肉制品中60%风味物质来源于脂质氧化，脂质变化对肉制品风味形成具有决定性作用，也是风味物质形成的主要途径[7]。干腌肉制品风味与脂质在加工成熟过程中有重要联系，脂质降解是该类肉制品风味形成主要来源，TOLDRA等[6-12]对此进行了相关研究。确定发酵肉制品最佳成熟时间，对于降低香肠产品加工成本及提高香肠食用品质及风味感官具有重要意义。

本课题组以清酒乳杆菌和木糖葡萄球菌为复合发酵剂，制作燕麦羊肉发酵香肠，探究成熟时间对发酵羊肉香肠食用品质、脂质氧化及风味物质积累的影响，旨在为香肠生产及品质改善提供数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

原料肉∶羊肉，肥肉和瘦肉，分别源自内蒙古锡林浩特市乌珠穆沁肉羊后腿及羊尾。肠衣：20～25 mm 胶原蛋白肠衣。熟制燕麦粉,呼和浩特东瓦窑市场。

发酵剂：清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)，由内蒙古农业大学肉品科学技术团队筛选、鉴定并保藏。

主要化学试剂：硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)(分析纯)，上海国药集团。

主要仪器：HD-3A 智能水分活度测量仪，深圳市银都科技有限公司；CR-410型色差计，日本柯尼卡美能达公司；TU-1800 紫外分光光度计，日本HMADZU公司；Master DHS 型动态顶空进样器、GC-MS DSQ II 型单四极杆气相色谱质谱联用仪，美国 Thermo 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵香肠制作

试验配方：羊后腿肉质量分数80%、羊尾肥膘质量分数15%、燕麦粉质量分数5%、蔗糖质量分数0.5%、食盐 2.5%、亚硝酸钠 70 mg/kg、葡萄糖质量分数0.5%、NaNO3100 mg/kg、抗坏血酸质量分数0.05%、发酵剂 107CFU/g(L.sakei∶S.xylosas=1∶2)。

工艺条件参照王德宝等[12]的方法并略作修改。

1.2.2 试验设计

通过预试验及单因素模拟试验，将清酒乳杆菌与木糖葡萄球菌作为复合发酵剂制作发酵燕麦羊肉肠。试验主要探究发酵成熟时间对燕麦羊肉香肠食用品质及感官的影响。分别于腌制后(0 d)、发酵结束(1 d)、成熟第一阶段(1～4 d)、成熟第二阶段(4～7 d)4个工艺点随机取样，测定不同阶段香肠的食用品质、脂质氧化及特征风味变化。剩余样品保存于-80 ℃。

表1 发酵香肠加工工艺条件Table 1 Processing conditions of fermented sausages

1.2.3 色差、水分活度(aw)、pH值、硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substance, TBARS)

参照GB 5009.237—2016 《食品pH值的测定》及BINGOL等[13-14]的方法测定香肠pH、TBARS值；使用智能水分活度仪、色差计测定香肠aw、亮度(L*)、红度值(a*)、黄度值(b*)。

1.2.4 风味测定

参照罗玉龙等[15]的方法略作修改，在 20 mL 样品瓶中加入 4 g 粉碎香肠样，将老化的萃取头插入样品瓶使石英纤维头暴露于样品上部空间，在 60 ℃条件下吸附 40 min 后拔出，萃取头在 GC 进样口(250 ℃)下解吸附 3 min。

挥发性风味成分测定的 GC-MS条件。GC 条件：TR-5 型毛细色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为 He，载气流速为1.0 mL/min，传输线温度250 ℃，不分流进样，进样时间1 min；升温程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升温到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升温到200 ℃，最后以20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。MS 条件：离子源温度250 ℃，进样口温度250 ℃，质量扫描范围(m/z)30～400。

质谱数据经与 MEANLIB、NISTDEMO 和 Wiley Library 检索定性，将匹配度大于 800 作为鉴定依据。

1.3 数据处理

采用 Excel 和 SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计处理和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 成熟时间对香肠pH值的影响

不同成熟时间下发酵香肠的pH值变化如图1所示。发酵成熟过程中，燕麦羊肉香肠pH值呈现先下降后上升再下降的变化规律。发酵1 d后香肠pH值由0 d时5.46降低到4.83，下降幅度达0.63。这是由于微生物发酵剂在发酵过程迅速繁殖，碳水化合物被利用和分解为乳酸、醋酸等小分子有机酸致使香肠pH值急剧下降，这与WANG等[16]研究结果相一致。成熟过程(1～4 d)香肠pH值呈现略微上升，这一结果可能是由于香肠中蛋白质逐渐被分解并伴随着氨类等碱性物质的形成所致[17]。成熟第一阶段(1～4 d)结束后，香肠pH值为4.89，显著低于肉制品发酵酸度要求5.3(P<0.05)[18]。成熟第二阶段(4～7 d)结束后，香肠pH值再次下降0.21，降为4.68，这可能由于成熟后期脂质等分解使香肠中脂肪酸等酸性物质增加所致[12]。

图1 不同成熟时间对发酵香肠pH值的影响Fig.1 Effect of different ripening time on the pH value offermented sausages注：不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)(下同)

2.2 成熟时间对香肠水分活度值(aw)的影响

aw与香肠中水分含量呈线性相关关系，其高低是衡量香肠保质期的一个重要栅栏技术因子。aw低于0.9时，食品中腐败菌生长受到抑制；低于0.85时，酶活性大幅下降；低于0.6时，霉菌及耐盐菌活性降到最低[19-20]。

如图2所示，腌制结束(0 d)后，对应aw约为0.95。发酵结束(1 d)后，香肠aw仍为0.95，这可能是因为香肠pH值急剧下降改变肌球重链蛋白对水分束缚能力[4]，释放的自由水弥补香肠中少量蒸发的水分。成熟第一阶段(1～4 d)，香肠所处环境温度、湿度分别由30 ℃、95%下调到15 ℃及80%～85%，使得香肠内部与外部形成较大水分梯度差，促使香肠中水分快速向外部迁移[21]。成熟第一阶段(1～4 d)结束，香肠aw降到0.83，下降幅度近0.12。有研究报道，分别低于pH 5.3和aw0.85有利于抑制香肠中有害菌、腐败菌的生长繁殖[5]，因此低pH值和aw值是保证香肠安全性能的重要指标。进入成熟第二阶段，温度下调到13～14 ℃，湿度下调为70%～75%，较第一阶段湿度下调幅度达10%；成熟结束后香肠aw值下降到0.69，较第一阶段下降近0.14。由上述结果可知，成熟2个阶段下降幅度差异显著(P<0.05)，成熟过程环境湿度和温度变化是影响香肠aw值下降关键因素。

图2 不同成熟时间对发酵羊肉香肠aw的影响Fig.2 Effect of different ripening time on the aw offermented sausage

2.3 成熟时间对香肠色泽的影响

衡量色泽指标包括亮度(L*)、红度(a*)及黄度(b*)。亮度(L*)反应香肠白暗程度，值越大表示香肠表面越鲜亮；红度(a*)表示香肠肉质鲜红色程度。当香肠亮度及红度值越高时，香肠肉质呈现诱人的玫瑰色泽。如表2所示，0～7 d香肠亮度值呈先下降后上升的趋势，4 d时香肠亮度值降到最低，但与原料肉、发酵结束及7 d时差异不显著(P>0.05)。香肠经发酵成熟后a*显著上升，显著高于原料肉a*(P<0.05)，表明发酵成熟工艺有助于改善香肠红度，这可能与低 pH 值促使亚硝酸盐与肌红蛋白结合形成亚硝肌红蛋白有关[22]。相比1、4、7 d 3个阶段香肠红度变化，1 d时a*最高，4 d时稍有下降，7 d时香肠a*较1 d时下降近4.5。0 d时，香肠b*值最低，显著低于其他3个阶段(P<0.05)，表明原料肉质较好；发酵1 d结束后，b*值达到最高，1～7 d成熟过程香肠b*呈下降趋势。综合香肠红度和黄度值，经发酵结束后成熟3 d时(即4 d)香肠色泽好于其他阶段。

表2 不同成熟时间对发酵香肠色泽的影响Table 2 Effect of different ripening time on the colorsof fermented sausages

注:同一列不同上标字母代表有显著性差异(P<0.05)，相同则差异不显著(P>0.05)(下同)

2.4 成熟时间对香肠脂质氧化(TBARS)值的影响

脂质氧化对肉制品风味形成和品控具有重要意义。脂质适度氧化可产生许多有利产品的特征风味物质，过度氧化则会给产品带来不愉快的风味[23]。脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde, MDA)是衡量脂质氧化程度和油脂酸败的主要指标[24]，MDA含量变化与脂质氧化程度呈现正相关。

不同成熟时间下发酵燕麦羊肉香肠的TBARS结果见图3。香肠TBARS值随发酵成熟时间延长呈先上升后下降再上升的变化趋势，各阶段香肠TBARS值均低于0.5 mg MDA/kg且差异显著(P<0.05)，表明香肠在整个成熟过程中脂质氧化分解处于正常范围[25]。发酵1 d结束后，香肠TBARS值由0.38增加为0.49 mg MDA/kg，高于香肠其他加工阶段。王瑞花等[26]与YOSHIDA等[27]研究高温烹制对猪肉脂质氧化的影响，发现高温长时烹制致使多不饱和脂肪酸含量下降、MDA含量增加，高温是猪肉中MDA含量增加的主要因素，因而上述结果可能是发酵过程中温度较高所致。1～4 d时，香肠TBARS值呈现下降趋势，在4 d结束时TBARS值降为0.39 mg MDA/kg。SUN等[5]研究表明乳酸菌和葡萄球菌抗氧化活性和抑制脂质氧化能力高于其他菌株。LIN等[28]研究表明菌株呈现的潜在抗氧化能力与它们的抗氧化酶系统(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶)及抑制物质(尿酸、谷胱甘肽、多糖、NADH和NADPH)有关。TBARS值下降的原因可能与发酵结束香肠中乳酸菌和木糖葡萄球菌数量急剧增加和抗氧化酶、抑制氧化物质生成有关。4～7 d时香肠中MDA含量又开始缓慢上升，这可能与此成熟过程中温度及水分活度(aw)下降，以及有关酶活性降低和抑制物质形成有关系。

图3 不同成熟时间对发酵香肠TBARS变化的影响Fig.3 Effect of different ripening time on the TBARS offermented sausages

2.5 成熟时间对香肠特征风味组成的影响

香肠中风味物质主要源于蛋白质及脂质氧化分解，如氨基酸Strecker降解、脂质氧化及Maillard反应是构成风味物质生成的主要途径[29]。封莉等[30]研究表明腌制腊肉制品风味形成主要依赖于脂质降解及氧化，醛类和酮类是脂质氧化的主要特征风味产物。也有研究表明，大多数支链醛是来自于氨基酸的Strecker降解[31]，由表3可知，中式香肠中的支链醛含量较少，可见Strecker降解在中式香肠的生产过程中对风味的贡献很微弱。

由表3可知，原料肉中检出30种风味物质，其中醛类物质9种(41.27%)，醇类物质7种(17.71%)，酯类物质8种(15.66%)，酮类物质2种(1.03%)，酸类物质1种(1.12%)，其他物质占总挥发性物质峰面积比为23.21%。可见原料肉中主要风味物质来自于醛类、醇类、酯类及其他萜烯类，其中醛类化合物是原料肉风味组成中主要成分。添加清酒乳杆菌及木糖葡萄球菌并经发酵成熟后，燕麦羊肉香肠中挥发性风味物质种类及含量呈现明显变化。1、4、7 d香肠中风味物质种类分别增加到33、37、41。随着成熟时间延长，香肠中风味物质含量呈现先上升后下降的趋势，含量在4 d时达到最高，且显著高于其他阶段(P<0.05)，醛类及醇类变化成为主要贡献源。综上,成熟时间对发酵燕麦香肠中挥发性风味物质组成具有显著影响。

表3 不同成熟时间对发酵香肠中风味组成的影响Table 3 Effects of different ripening time on the flavor composition of fermented mutton sausages

续表3

类别序号中文名英文名CAS号分子式保留时间峰面积(×107)0 d1 d4 d7 d占总挥发性物质峰面积百分比/% 15.669.804.028.66酮类384-羟基-2-丁酮4-Hydroxy-2-butanone590-90-9C4H8O211.530.09±0.01a—0.13±0.00a0.20±0.01a393,5-辛二烯-2-酮3,5-Octadien-2-one30086-02-3C8H12O14.560.24±0.02a——0.15±0.09a403-羟基-2-丁酮2-Butanone, 3-hydroxy-513-86-0C4H8O23.45———0.12±0.01总量0.33—0.130.57占总挥发性物质峰面积百分比/% 1.03—0.241.39酸类41乙酸Acetic acid64-19-7C2H4O21.860.36±0.04a0.47±0.13a1.58±0.17b1.89±0.10b总量0.360.471.581.89占总挥发性物质峰面积百分比/%1.121.512.964.6042β-蒎烯Bicyclo[3.1.1]heptane, 6,6-dimethyl-2-methylene-, (1S)-18172-67-3C10H1612.381.63±0.09b0.77±0.04a1.25±0.05ab0.94±0.02a萜类432-正戊基呋喃Furan, 2-pentyl-3777-69-3C9H14O12.712.93±0.22a2.68±0.19a5.79±0.60b3.47±0.10a及44D-柠檬烯D-Limonene5989-27-5C10H1613.531.53±0.20a1.53±0.16a1.52±0.19a1.53±0.01a其他45γ-松油烯γ-Terpinene99-85-4C10H1614.110.36±0.16ab0.29±0.06a0.22±0.02a0.43±0.03b46草蒿脑Estragole140-67-0C10H20O216.640.49±0.09b0.41±0.03b0.44±0.05b0.28±0.02a47茴香脑Anethole104-46-1C10H12O18.000.53±0.09a0.71±0.08a0.57±0.10a0.51±0.05a48α-蒎烯α-Pinene80-56-8C10H1611.25———0.32±0.01总量7.476.399.797.48占总挥发性物质峰面积百分比/% 23.2120.5918.3218.19

注：“—”表示未检出峰

相比香肠中其他挥发性风味物质，醛类物质在成熟过程中占总挥发性风味达50%以上，这与西式干发酵香肠风味组成结果相一致[32]。低阈值并呈现广泛香气的醛类是发酵肉制品中重要特征风味物质[33]。特别是C6-C10的醛类是所有熟肉肉制品中重要风味物质[34]。由表3可知，含量最高的3种醛类分别是庚醛、壬醛和己醛。己醛具有青草味，庚醛和正壬醛呈现油脂香味，3 种醛类的前体是亚油酸和亚麻酸[35-36]。亚油酸自动氧化生成 C9-和 C13-的氢过氧化物，而C13-的氢过氧化物裂解产物为正己醛[37-38]。正己醛是脂质氧化标志性产物，其浓度代表脂肪氧化状态及熟肉风味形成[39]。且4 d时正己醛、庚醛及壬醛含量高于1和7 d，因此选择合适成熟时间有助于提高香肠中特征风味物质含量。有研究报道，支链氨基酸(如亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等)通过Strecker降解可形成较多支链醛[40]。亮氨酸在微生物代谢作用下生成3-甲基丁醛，其阈值较低，低浓度条件下具有愉快的麦芽香气和水果香气[41]，对发酵肉制品风味有显著贡献，也可与含硫化合物进一步反应产生类似培根的风味[42]。而香肠中支链醛类仅在成熟7 d时检出3-甲基丁醛且含量较低，可知Strecker降解对香肠风味贡献较弱。

图4 燕麦羊肉香肠中风味化合物离子流图Fig.4 Ion flow diagram of flavor compounds in oatmeallamb sausage

相比醛类，醇类化合物阈值较高，较多不饱和醇类有很好的香味。香肠正己醇和乙醇含量较高，随着成熟时间延长其含量逐渐下降，这可能是其与酸类结合生成酯类有关。其次，香肠中1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇又被称为蘑菇醇，具有浓郁的蘑菇香味，主要是来自于前体物——花生四烯酸和亚油酸的脂质氧化[43]，其含量随成熟时间延长而增加，为香肠中香味组成做出重要贡献。苯甲醇也是重要芳香醇之一，常以酯类形式存在于玫瑰香油或香肠中。其他醇类为酯类的形成提供重要前体。香肠中酯类含量低于醇类，而酯类物质具有典型的水果香气，其存在可使香肠因短链酸类带来的尖刺感变得更加柔和，且高含量的乙酯类风味物质是中式香肠有别于其他肉制品风味的典型特征[44]。酯类含量随香肠成熟时间呈现先下降后上升的趋势，总含量在4 d时最低。且香肠中酯类主要以短链C3-C10为主，而C10酯类占总酯类百分比≤20%。说明随着成熟时间延长有助于短链醇类向酯类转变。酯类物质具有典型的水果香味，如己酸甲酯、己酸乙酯、己酸戊酯及辛酸甲酯和辛酸乙酯具有典型菠萝香型的香气，加工4 d时上述酯类风味物质含量均高于1和7 d时含量，说明加工时间对水果香型酯类风味物质在香肠积累具有重要影响。

酮类物质可赋予香肠水果香味、花香。发酵香肠中检出 3-羟基-2-丁酮和 4-羟基-2-丁酮，原料肉仅检出 4-羟基-2-丁酮。3-羟基-2-丁酮常被叫做乙偶姻，具有强烈的奶油、脂肪香味，高度稀释后具有令人愉快的奶香味，仅在7 d时检出。3-羟基-2-丁酮的生成是由于香肠中葡萄糖代谢产生二乙酸，最终转化为3-羟基-2-丁酮[45]。检出的酸类是经异型发酵而来的乙酸，香肠含量随加工时间呈现上升趋势，且4与7 d差异不显著(P>0.05)。此外，发酵羊肉香肠中还检出了β(α)-蒎烯、D-柠檬烯、γ-松油烯、2-正戊基呋喃、草蒿脑、茴香脑，并且总相对含量在4 d时达到最高为9.79。2-正戊基呋喃是亚油酸自动氧化的产物，是含脂食品中重要的香味物质[46]，且含量同样在4 d时达到最高。综上，成熟时间对发酵羊肉香肠风味积累具有影响作用，且在加工4 d时整体风味相对含量达到最高。