APP下载

青钱柳叶抗氧化物质积累的差异性研究

2020-06-15郑晓杰林胜利吴聪聪聂小华

食品与发酵工业 2020年11期
关键词:山奈青钱柳酚类

郑晓杰,林胜利,吴聪聪,聂小华

1(温州科技职业学院(温州市农业科学研究院),浙江 温州,325006) 2(文成县现代农业与康养产业研究院,浙江 温州,325006) 3(浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州,310014)

青钱柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinskaja),又名青钱李、摇钱树和麻柳等,是我国特有的胡桃科青钱柳属药食同源植物,主要生长于我国湖南、江西、浙江、福建、贵州等地,其嫩叶在民间常用于制作甜茶饮料,可清热解暑和生津止渴。已有研究表明,青钱柳叶含有丰富的酚类物质,如咖啡酸、槲皮素、山奈酚及其衍生物等[1-2],槲皮素和山奈酚含量[3]均高于其他22种果蔬和植物[4];且青钱柳叶酚类物质可降低体内氧化应激,具有保护组织氧化损伤的功效[5-6]。2013年,青钱柳叶被国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料,与其相关的保健茶与保健食品相继出现。

酚类物质是植物中重要的次级代谢产物,它的积累与种源、产地和采收期等有着密切关联[7]。由于产地环境和采收时间的不同,青钱柳生理生化进程可能不一致,酚类物质组成与含量由此发生变化,不同地理种源青钱柳叶中酚类物质及抗氧化活性存在较大差异[8-9]。当前青钱柳人工种植已成为趋势,现有研究多集中于种源评价[8-9]、种植条件等[10-11],探究同种源不同产地青钱柳嫩叶抗氧化物质积累情况,对于青钱柳资源的开发利用极为重要。本课题组以浙江文成和湖南张家界两地的同种源5年生青钱柳为试验材料,采用体外抗氧化方法和高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法,剖析5月中旬~9月中旬嫩叶自由基清除能力、总还原力、总酚含量、总黄酮含量、酚类物质组成与含量等动态变化,并通过相关分析明确酚类物质对抗氧化活性的贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

1.1.1 主要材料与药品

2018年5月中旬~9月中旬采集浙江文成(WC)、湖南张家界(ZJJ)两地的青钱柳枝条中上部嫩叶,经60 ℃干燥、粉碎和60目筛分后,置于干燥器中保存备用。其中ZJJ青钱柳是浙江文成栽培基地(即WC青钱柳)的引进种源。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS];(+)-儿茶素、 2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷,Sigma-Aldrich公司、美国Sigma- Aldrich公司;抗坏血酸、没食子酸、芦丁和福林酚试剂,上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

CS-700磨粉机,浙江武义海纳电器有限公司;Mas-2微波萃取仪,上海新仪微波化学技术科技有限公司;CR22N/CR21N高速冷冻离心机,日本日立公司;752型紫外分光光度计,上海光谱仪器有限公司。Ultimate 3 000 HPLC - Q Exactive液质联用仪,美国Thermo Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 青钱柳叶的微波辅助乙醇提取

青钱柳叶粗粉经石油醚脱脂处理后,挥发去除石油醚;按料液比1∶30(g∶mL)加入体积分数75%乙醇,进行微波提取,微波功率500 W,50 ℃下提取10 min;提取2次,合并提取物。

1.2.2 DPPH清除能力测定

参照LIU等[9]的方法。2.0 mL样液中加入等体积0.1 mmol/L DPPH溶液,混匀,室温避光放置30 min,515 nm下测定其吸光度。以抗坏血酸作标准曲线,DPPH清除能力以每克青钱柳干样品(dry matter, DM)中所含抗坏血酸当量(ascorbic acid equivalent, AAE)表示 (μmol AAE/g·dm)。

1.2.3 ABTS清除能力测定

1.2.4 总还原能力测定

采用铁氰化钾还原法[12]。2.0 mL样液中加入等体积0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.5)和10 g/L铁氰化钾,混匀,50 ℃下反应20 min,加入1 mL 100 g/L三氯乙酸和0.4 mL 1 g/L FeCl3,混匀,静置10 min,700 nm下测定其吸光度。以抗坏血酸作标准曲线, 总还原能力以1 g青钱柳干样品中所含抗坏血酸当量(gallic acid equivalent, GAE)表示 (μmol GAE/g dm)。

1.2.5 总酚的测定

采用福林酚法测定[13]。0.5 mL样液中加入2.5 mL 0.2 mol/L福林酚试剂,混匀静置5 min后加入2.0 mL 75 g/L Na2CO3,混匀后静置60 min,765 nm下测定其吸光度。以没食子酸为标准品,总酚含量以1 g青钱柳叶干样品中所含没食子酸当量表示(μmol GAE/g dm)。

1.2.6 总黄酮含量测定

采用三氯化铝法[8]测定。0.5 mL样液中加入2.0 mL体积分数30%乙醇和2.0 mL 10 g/L AlCl3,混匀,静置10 min,420 nm下测定其吸光度。以芦丁为标准品,总黄酮含量以1 g青钱柳叶干样品中所含芦丁当量(rutin equivalent, RE)表示(mg RE/g dm)。

1.2.7 HPLC- MS/MS分析

色谱条件:Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为0.1%甲酸,流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:流动相初始10% B,保持5 min,5~25 min内B浓度升至90%,保持8 min,最后7 min内降低至5% B;流速0.8 mL/min,上样体积5 μL,柱温40 ℃,二极管阵列检测器检测波长200~400 nm。

质谱条件:采用HESI离子源,负离子模式,喷雾电压3.2 kV;翘气速率40 mL/min,辅助气速率10 mL/min;毛细管温度300 ℃,S-lens 50%,扫描模式Full ms/dd-ms2 top5;一级扫描分辨率70 000,范围100~1 500m/z;二级扫描分辨率17 500,起始离子50m/z。采用离子峰和碎片离子峰特征进行MIST数据库检索。

以2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、(+)-儿茶素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-新橘皮糖苷为标准物,采用上述色谱条件进行定量分析。

1.2.8 统计分析

每组样品平行测定3次, 均值、标准偏差计算及作图采用Excel软件;采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析和Pearson相关系数分析。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化活性的动态变化

DPPH法、ABTS法和总还原能力是评价物质抗氧化活性的常用指标,由此体现其供氢能力或供电子能力,浙江文成(WC)和湖南张家界(ZJJ)两地的同种源青钱柳叶抗氧化活性如图1所示。结果表明,青钱柳叶提取物可有效清除DPPH和ABTS自由基以及还原Fe3+成Fe2+,且存在着采收期变异性和产地变异性。随着采收时间的延迟,WC青钱柳叶DPPH清除能力、ABTS清除能力和总还原能力均呈现先增后降的动态变化,8月达到峰值,分别为162.26、214.04 和188.33 μmol AAE/g dm;ZJJ青钱柳叶上述3种抗氧化活性则表现为增加-降低-增加的双峰态分布特征,其最大峰值分别为141.88(9月)、196.68(9月)和166.44 μmol AAE/g dm (6月)。据报道,植物提取物的抗氧化活性变化曲线以单峰为主,但也存在双峰或多峰分布,其动态变化也可能存在不一致性[12,14],这主要是因为不同产地和采收期下,植物体内酚类物质组成与含量不同[7],化学结构在很大程度上影响着酚类物质的抗氧化性[14-15]。与ZJJ相比,WC青钱柳叶在7、8月具有较高的自由基清除能力和总还原能力。从抗氧化活性角度出发,WC青钱柳叶在8月采收最佳,而ZJJ青钱柳叶在6月和9月采收比较合适。

图1 青钱柳叶自由基清除能力和还原力的动态变化Fig.1 Variation of radical scavenging activity and reducing power in C. Paliurus leaves

2.2 抗氧化物质积累的动态变化

酚类物质是植物体内重要的抗氧化物质,其积累受到植物种源、产地和采收期等诸多因素影响[3-6]。浙江文成和湖南张家界两地的同种源青钱柳叶中总酚和总黄酮的积累如图2所示。随着采收时间的延迟,WC青钱柳叶总酚含量、总黄酮含量表现出先增后降的趋势,均在8月达到峰值,分别为44.38 mg GAE/g dm和27.96 mg RE/g dm。ZJJ青钱柳总酚含量则在5~9月采收期内呈双峰态特征,9月达到最大峰值(40.56 mg GAE/g dm);总黄酮含量在5~8月内无明显变化,基本在19.14~20.84 mg RE/g dm范围内波动,然后快速增加到25.78 RE/g dm(9月),该结果有别于FANG等[3]和柏明娥等[16]报道,但ZHANG等[13]也发现杜仲叶中黄酮与多酚的积累表现出不同的采收变化规律。与ZJJ青钱柳叶相比,WC青钱柳叶7月和8月积累大量的多酚类物质,5~8月内积累较多的黄酮类化合物。

图2 青钱柳叶中酚类物质积累的动态变化Fig.2 Variation of phenolic accumulation inC. Paliurus leaves

上述结果说明青钱柳叶中酚类物质的积累不仅受采收期影响,同时存在明显的产地差异。这是因为酚类物质作为植物次级代谢产物,随着生长时间的推移,其单体组成与含量随之发生变化,且与生长环境密切相关[7]。为了获得较高含量的酚类物质,WC青钱柳叶8月采收最佳,而ZJJ青钱柳叶以6月和9月采收比较合适。

2.3 酚类物质的定性和定量分析

考虑到浙江文成和湖南张家界两地的同种源青钱柳叶分别在8月和6月达到抗氧化活性的峰值,本文采用HPLC-MS/MS 法对其提取物进行物质的定性分析,结果如表1所示。青钱柳叶提取物中初步鉴定出12种酚类物质,分别为2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、(+)-儿茶素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、槲皮素-3,4′-二甲醚、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷、四甲基木犀草素、3′,4′-二羟基-α-萘黄酮、圣草酚-7-O-葡萄糖苷和3′,4′-二甲氧基-2′-羟基查尔酮。其中4-O-咖啡酰奎宁酸、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷已在青钱柳叶被广泛检出[8-11],张晓瑢等[17]也在青钱柳叶中分离鉴定出(+)-儿茶素,但2,3-O-二咖啡酰酒石酸、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷等尚未有相关报道。进一步对2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、(+)-儿茶素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-新橘皮糖苷等7种物质进行积累量分析,结果如表2所示。其中(+)-儿茶素仅在WC青钱柳叶中检出,山奈酚-3-O-葡萄糖苷仅在8月采集的ZJJ青钱柳叶中检出;4-O-咖啡酰奎宁酸是青钱柳叶中主要积累的酚类物质,其次为槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷和2,3-O-二咖啡酰酒石酸。同种源、不同产地的青钱柳叶不仅在酚类的组成上存在很大的差距,且其积累量也存在很大差异,这与采收期密切关联。魏娜等[18]也指出,同一品种、不同生态区域的青稞中黄酮和花青素差异显著。

表1 青钱柳叶提取物中酚类物质的定性分析Table 1 Qualitative analysis of phenolic compounds in C. paliuru leaves

表2 青钱柳叶提取物中酚类物质积累量的变化 单位:mg/g

注;a~d表示同一种物质在不同采收时间的含量存在显著性差异(P<0.05);nd表示未检出

2.4 青钱柳叶酚类物质与抗氧化活性的相关性分析

采用Pearson相关分析法评价青钱柳叶中总酚、总黄酮、共同存在的酚类物质(2,3-O-二咖啡酰酒石酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷和山奈酚-7-O-新橘皮糖苷)等含量与抗氧化活性的相关性,结果如表4所示。青钱柳叶的3种抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、还原力)均与总酚含量、2,3-O-二咖啡酰酒石酸含量存在着高度的正相关 (r=0.910~0.982),与总黄酮含量、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷含量存在着一定程度的相关性(r=0.448~0.683);但与4-O-咖啡酰奎宁酸和槲皮素-3-O-鼠李糖苷的含量之间相关性很低,r仅为0.158~0.330。相关性分析说明总酚和总黄酮是青钱柳叶抗氧化活性的物质基础,其中2,3-O-二咖啡酰酒石酸起着较为重要的作用;这和LIU等[9]、CAO等[14]的研究有所不同。但早期研究表明2,3-O-二咖啡酰酒石酸具有良好的抗氧化活性,可有效清除自由基[25-26]。

表3 青钱柳叶酚类物质含量与抗氧化活性的相关分析Table 3 Pearson correlation between antioxidant capacityand phenolic compound content of C. paliurus leaves

注: * 和 **分别表示显著性差异P<0.05和P<0.01

3 结论

青钱柳是广泛分布于我国南方的药食同源植物,由于天然资源的不足,引进优良种源进行人工栽培已成为趋势。浙江文成和湖南张家界两地的青钱柳为同一种源,且产地的地理环境较为接近(纬度、年平均气温和年降雨量),但其抗氧化活性、总酚含量和总黄酮含量随采收期的延迟依然表现出截然不同的变化趋势,酚类物质组成及其积累量也存在着很大的差异,这说明产地对青钱柳叶抗氧化物质有着很大的影响。因此,引进优良种源的同时,宜根据产地适当调整采收期, 以满足青钱柳叶质量控制和后期开发。此外,总酚和总黄酮是青钱柳叶抗氧化活性的物质基础,其中2,3-O-二咖啡酰酒石酸起到较为重要的作用。

猜你喜欢

山奈青钱柳酚类
山奈酚-铜配合物的合成、表征及抗氧化活性研究
山奈的活性成分及在食品工业中应用的研究进展
青钱柳饼干加工工艺参数优化研究
倒挂金钩中酚类成分的研究
4种山奈属植物光合特性的比较研究
黄荆酚类成分的研究
青钱柳叶对糖尿病大鼠的治疗作用
青钱柳质量标准的研究
车前子酚类成分的研究
莲都区首次发现国家二级保护树种——青钱柳