野生酿酒酵母和葡萄汁有孢汉逊酵母混菌发酵对玫瑰香葡萄酒香气的影响

阎贺静，张鸣宇，孙康，杨晓宽，葛超，周洁芳，刘畅，邹静

(河北科技师范学院 食品科技学院，河北 昌黎，066600)

玫瑰香葡萄是麝香类葡萄，具有浓郁的玫瑰香气，因此不同类型的玫瑰香葡萄酒广受欢迎。目前我国玫瑰香葡萄酒的酿造均使用活性干酵母(酿酒酵母Saccharomycescerevisiae)作发酵剂，虽然该过程发酵速度快、并易于控制，但容易导致葡萄酒同质化问题，使玫瑰香葡萄酒缺乏品种特色和地域特征。随着对非酿酒酵母(non-Saccharomycescerevisiae, NSC)研究的深入，发现许多NSC对葡萄酒的风味和感官具有积极作用[1]。在葡萄自然发酵醪中存在的大量NSC，例如Hanseniasporaguilliermondii(季也蒙有孢汉逊酵母),Torulasporadelbrueckii(德尔布有孢圆酵母),Schizosaccharomycespombe(栗酒裂殖酵母),Zygosaccharomycesbailii(拜耳结合酵母),Candidazemplinina(泽姆普林纳假丝酵母),Lachanceathermotolerans(旧称作耐热克鲁维酵母，Kluyveromycesthermotolerans)和Candidaapicola(蜂生假丝酵母)均具有优良的发酵特性，能够存活于整个发酵过程[2]。尤其是Lachancea、Metschnikowia、Torulaspora和Pichia等属的酵母已制备成商业化的菌剂[3]。许多研究证实，对S.cerevisiae和NSC的混菌发酵进行良好的控制，可以大大增加葡萄酒香气的复杂性[4-5]。这既避免了葡萄酒酸败的风险，同时又保留了自然发酵的优势，可以突出葡萄酒的品种特色和地域特征。因此，S.cerevisiae与NSC混菌发酵对特色葡萄酒的酿造具有非常重要的意义。

昌黎是我国历史悠久的葡萄与葡萄酒产区，种植大量的玫瑰香葡萄。课题组前期从玫瑰香葡萄自然发酵醪中分离获得了1株S.cerevisiaeHBKS-Y1和1株葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)HBKS-Y3，并对其发酵特性进行了研究[6]。本文进一步考察了HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌发酵过程以及其对玫瑰香葡萄酒香气的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 原料

玫瑰香葡萄，2016年9月采自昌黎葡萄沟(中国)，含糖浓度235.4 g/L(以还原糖计)、可滴定酸浓度5.10 g/L(以酒石酸计)、pH 3.21。

1.1.2 菌种和培养基

活性干酵母：商用活性干酵母FX10，法国Laffort公司；酿酒酵母HBKS-Y1和葡萄汁有孢汉逊酵母HBKS-Y3，均为本课题组前期从玫瑰香葡萄自然发酵醪中分离获得[6]，由河北科技师范学院酿酒工程实验室保藏。

YPD培养基(g/L)：酵母浸提物10，蛋白胨 20，葡萄糖20，琼脂20(固体培养基添加)。

赖氨酸培养基(g/L)：赖氨酸 5.6，葡萄糖 10，KH2PO40.85，Mg3(PO4)20.5，琼脂 20。

1.1.3 试剂

甘油和乙醛含量测定试剂盒,爱尔兰Megazyme公司;本研究所用其他试剂均为分析纯。

1.1.4 主要仪器和设备

7890B-5977气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司;固相微萃取针头30/40 μm Polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB)，美国 Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵和取样

玫瑰香葡萄除梗破碎、去皮渣，70 ℃处理30 min，取100 μL涂布于YPD培养基，28 ℃培养48 h检验除菌效果[7]。分别在400 mL除菌葡萄汁中接入活性干酵母FX10、HBKS-Y1、HBKS-Y3、HBKS-Y1和HBKS-Y3(接种比例为1∶9)，接种量为106CFU/mL培养基，编号分别为F1、F2、F3和F4， 20 ℃培养至发酵结束，每天定时取样进行酵母计数。分别取3 L除菌葡萄汁，按以上接种策略接种和发酵，所得酒样进行理化指标、香气成分分析和感官评价。

1.2.2 酵母计数

酵母菌总数使用YPD 培养基，H.uvarum的计数用赖氨酸培养基(S.cerevisiae不能在赖氨酸培养基中生长)。发酵样品用无菌水梯度稀释，取适合梯度稀释菌液100 μL 分别涂布于YPD 和赖氨酸培养基，28 ℃培养48 h 后进行计数。

1.2.3 理化指标测定

pH计测定pH，还原糖、乙醇、总酸、挥发酸和比重的测定根据GB/T 15038—2006进行，发酵液中甘油和乙醛含量均采用试剂盒测定。

以上所有实验均设置3个重复。

1.2.4 香气成分测定

采用安捷伦90A-5975C气相色谱仪联合质谱仪测定酒样挥发性成分。酒样离心，取5 mL上清液加入至含有1.0 g NaCl和10 μL 2-辛醇 (内标) 的20 mL样品瓶中，密封，1 100 r/min搅拌，40 ℃预热30 min后插入30/40 μm Polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB)固相微萃取头，40 ℃萃取30 min，然后将萃取头插入GC进样口，250 ℃解吸附5 min。色谱条件：载气为He，流速为1.0 mL/min (不分流)，色谱柱为HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。气相色谱升温程序：起始温度50 ℃，保温1 min后以3 ℃/min升温至230 ℃，保温10 min后以5 ℃/min升温至250 ℃，保温3 min 后降温至40 ℃。质谱条件：扫描范围为m/z33～450，进样口温度250 ℃。挥发性成分的定性分析通过对比质谱库(NIST)的保留时间，挥发性成分的半定量分析通过内标计算色谱峰面积进行。

1.2.5 感官分析

邀请10位受过专业训练的人员，采用稍作改良的定量分析法(quantitative descriptive analysis, QDA)[8]对所酿葡萄酒进行感官评价。对酒样的色泽、花香、果香、玫瑰香、异味、酸度、甜度、酒体及总接受度共9个属性进行评价，用8分结构化数值进行定量描述，每个属性得分介于0～8，分值大小表示感官对每个属性的感知强度。计算每个属性的平均分值并绘制多边形图。

1.2.6 数据处理

采用Excel 2010 进行数据处理，对化学成分和挥发性成分进行方差分析，采用Excel 2010 和Origin软件绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵过程分析

图1为不同发酵过程的还原糖消耗曲线。结果表明，所有野生酵母参与的发酵过程(F2、F3和F4)的发酵速度均比活性干酵母发酵(F1)速度低，其中HBKS-Y3单菌发酵速度最低(F3)，但所有的发酵均能在14 d内完成发酵，且葡萄酒样符合标准葡萄酒指标要求(表1)。大多数早期研究认为H.uvarum只存在于葡萄酒发酵的早期阶段，由于酒精耐性较低及其他原因不能完成酒精发酵[9]。以上的结果说明，本研究中的野生H.uvarumHBKS-Y3具有一定的酒精耐性和发酵能力。

图1 发酵过程残糖变化曲线Fig.1 Residue sugar content during the fermentation

表1为4个不同发酵酒样的理化指标。F1、F2和F4酒样的酒精度在11%～13%vol范围内，各项理化指标值也较为相似，挥发酸含量介于0.4～0.7 g/L，符合葡萄酒对挥发酸含量的常规需求。而F3酒精度较低(9.07%)，挥发酸含量达0.81 g/L，接近引起不良风味的感官阈值(0.7～1.0 g/L)。所有酒样甘油含量没有显著差异，均在4.75～5.55 g/L范围内，也在葡萄酒中常见的甘油含量5～20 g/L范围内。乙醛是影响葡萄酒风味的重要物质之一，红葡萄酒中的含量通常介于40～80 mg/L。F2和F3酒样中乙醛含量显著高于F1和 F4，其中F3乙醛含量最高(69.37 mg/L)(表1)，但低于其风味阈值100～125 mg/L。

尽管F3的挥发酸、滴定酸较高，但该菌在混菌发酵(F4)中并没有引起挥发酸总量的升高，这表明HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌发酵可以降低酒样中挥发酸和总酸的含量，该结果与前期有关H.uvarum和S.cerevisiae混菌发酵降低挥发酸和总酸产量的研究结果一致[10]。

表1 不同发酵酒样的理化指标Table 1 Final results of the fermentation with the indigenous yeast strains

2.2 发酵过程中酵母生长曲线

图2为不同发酵过程的酵母生长曲线。商用活性干酵母FX10和HBKS-Y1的单菌发酵 (F1和F2)中S.cerevisiae的生长曲线没有显著差异(图2-a)，S.cerevisiae的细胞数量均在发酵的第3天达到最大值(108CFU/mL)，直到发酵结束变化不大。而F4中的野生S.cerevisiae的细胞数量最大值未达到108CFU/mL(图2-b)。文献报道混菌发酵中的NSC会影响S.cerevisiae细胞的生长[5]，本文的研究结果验证了这一影响作用 (图2)。

F3和F4中HBKS-Y3的数量在发酵的第2天均达到最大值，分别为7.73×107和 7.48×107CFU/mL，之后开始下降(图2-a)。图2的数据同时说明野生HBKS-Y3单菌也能完成酒精发酵，与图1数据结果一致。此结果与HONG等[11]的研究结果一致。但与ANDORR等[12]的研究结果不同。

a-单菌发酵;b-混菌发酵图2 葡萄汁发酵过程中酵母细胞生长曲线Fig.2 Evolution of yeast population during Muscatjuice fermentation

F4发酵结束时，HBKS-Y3的数量远低于F3。说明混菌发酵时大量存在的HBKS-Y1抑制了HBKS-Y3的生长[13]。据报道，对酿造环境例如高乙醇体积分数的低耐受性是导致混菌发酵过程中NSC死亡的主要原因之一[9]。但本研究中的混菌发酵早期，并没有出现HBKS-Y3的大量死亡，说明在与HBKS-Y1混菌发酵的前4 d，HBKS-Y3生长情况良好，这一结果与BEZERRA-BUSSOLI等[14]有关H.uvarum-S.cerevisiae混菌发酵的研究结果一致。这表明，本研究中的HBKS-Y3具有较高的酒精耐受性。传统观点认为，混菌发酵中，直到酒精度达到4%～7%vol，NSC通常会以较高的浓度存在。然而，许多研究表明，接种H.uvarum进行混菌发酵，可以获得高于7%酒精度[11,15]。以上结果说明，酒精并不是引起混菌发酵过程中NSC早期死亡的唯一因素。NISSEN等[16]的研究认为，高浓度的S.cerevisiae细胞似乎通过群体细胞感应引起NSC细胞的死亡。已有的一些研究发现，S.cerevisiae分泌的一些中、短链脂肪酸、蛋白质和抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)以及酵母细胞间的群体效应也很有可能是导致混菌发酵体系中NSC细胞死亡的重要因素之一[12,17-18]。但目前对混菌发酵过程中S.cerevisiae与NSC交互作用的机制并不清晰，许多相关研究的结果存在着不一致的情况。说明S.cerevisiae与NSC交互作用存在种间和种内差异，同时也和接种策略及发酵条件有关。具体原因需要通过设计不同的接种策略、发酵条件、营养条件等试验进一步确定。

2.3 挥发性成分分析

从4个酒样中共检测到包括酯类、高级醇、萜烯物质和酮类等在内的24种芳香成分，结果见表2。

2.3.1 酯类物质

发酵酯类物质对葡萄酒的水果香气具有重大影响作用，尤其对年头尚早的红葡萄酒和白葡萄酒。表2给出了不同发酵酒样中酯类物质的种类和浓度。F3和F4酒样中具有较高含量的酯类物质，这一结果与前期有关H.uvarum和S.cerevisiae的研究结果一致[19]。据报道，H.uvarum具有较强的酯类物质分泌能力，可以与S.cerevisiae混菌发酵可以提高酒样中酯类物质的含量，这也是近些年来H.uvarum越来越受关注的主要原因之一。

表2 不同发酵酒样中的主要香气成分Table 2 Aroma compounds identified in Muscat winesfrom different fermentations

注：“-”表示未检测出

乙酸乙酯是葡萄酒中最主要的酯类物质之一，其阈值为150～200 mg/L，超过此值会使葡萄酒具有馊味。含量为80 mg/L左右时，赋予葡萄酒水果香味，同时可以增加葡萄酒的风味复杂性。Hanseniaspora属的酵母被认为是一种优良的酯类物质生产菌，通常会引起高含量的乙酸乙酯[20]，本文结果证实了这一点。本研究中HBKS-Y3发酵(F3)酒样中乙酸乙酯的含量显著高于其他酒样。而HBKS-Y3和HBKS-Y1发酵(F4)酒样中，乙酸乙酯的含量显著降低。F3酒样中乙酸乙酯的含量为 95.507 mg/L，分别比F1和F2高10.348和5.189倍，而仅比F4酒样高2.070倍。这表明混菌发酵中S.cerevisiae细胞的存在抑制了H.uvarum对酯类物质的代谢。在先前的一些混菌发酵研究中也发现了类似的交互影响作用[19-20]。

丁酸乙烯酯、己酸烯丙酯和2-氧环戊基乙酸乙酯是F2酒样中主要的酯类物质，但在F3中这些酯类物质的含量较低，而F4酒样中没有检测到氧环戊乙酸乙酯。HERRAIZ等[21]研究发现S.cerevisiae是这些酯的强生产菌，接种尖端酵母H.uvarum可使这些酯减少。而表2数据表明，除己酸烯丙酯外，商用S.cerevisiae(FX10)对丁酸乙烯酯、2-氧环戊基乙酸乙酯并没有表现出强的生产能力(F1)。推测认为，S.cerevisiae对这些酯的生产能力存在种内差异。

2.3.2 高级醇

4种发酵中，尤其是有HBKS-Y3参与(F3或F4)的发酵与有S.cerevisiae参与(F1、F2和F4)的发酵中高级醇的种类和含量显著不同。F1与F2中分别检测到5和6种高级醇。而F3和F4中分别只检测到4种高级醇。只在F2中检测到了十二烷醇和2-甲基-丁醇，而环己-2-烯-1-醇只在S.cerevisiae参与(F1和F2)的发酵中检测到。在所有酒样中均检测到了异戊醇和2-苯乙醇，但含量显著不同。异戊醇是葡萄酒中最重要的高级醇，具有独特的刺鼻气味，在葡萄酒中的浓度通常在90～300 mg/L之间。高浓度的异戊醇对葡萄酒风味有不利影响，低浓度对葡萄酒风味有积极影响。本研究中，F1酒样中异戊醇的含量明显高于其他发酵酒样，而F3中异戊醇的含量最低。

2-苯乙醇是葡萄中苯丙酸代谢的衍生物，具有玫瑰般的花香，是麝香葡萄酒特征香气成分之一。在本研究中，F4中2-苯乙醇含量最高，F1次之。HBKS-Y1单菌发酵酒(F2)中的2-苯乙醇的含量最低，但与HBKS-Y3混菌发酵后(F4)，2-苯乙醇的含量分别比单菌发酵(F2和F3)增加了1.83和0.68倍。由此可见，HBKS-Y1与HBKS-Y3混菌发酵有利于突出玫瑰香葡萄酒的特征香气。

高级醇具有强烈而刺鼻的气味，对葡萄酒的味道和品质有重要的影响。高浓度或低浓度的高级醇会对葡萄酒的风味产生不利影响。含量过少会使葡萄酒的风味淡薄；含量过多会给人以辛辣、腐臭感和不悦的苦涩味。另外，高级醇含量过多还对人体有麻醉作用或使饮用者中毒。因此，有必要降低葡萄酒中的高级醇含量以改善葡萄酒的风味。在本研究中，高级醇的含量大约在108～223 mg/L范围内，这个含量范围的高级醇通常在葡萄酒中广泛存在。在4个发酵酒中，F3高级醇总量最低，F2最高。文献报道表明，与S.cerevisiae单菌发酵相比，尖端酵母单菌发酵及其与S.cerevisiae混菌发酵的高级醇量均有所降低[15,20]。本研究的结果与以上文献不太一致，HBKS-Y3单菌发酵高级醇含量最高，此HBKS-Y1混菌后高级醇含量降低了10.04%。

2.3.3 萜烯类物质

萜类物质具有强烈的芳香气味，且阈值较低，是玫瑰香葡萄和玫瑰香葡萄酒中的典型香气成分。此外，单萜醇类物质例如芳樟醇(里哪醇)、香茅醇、香叶醇和橙花醇是玫瑰香葡萄中含量最丰富的典型香气成分。表2结果表明，4个发酵酒中共发现9种萜类化合物，其中芳樟醇(里哪醇)和松油醇含量均显著高于其他萜类化合物。它们是麝香葡萄果肉和果皮中的主要成分，对该葡萄品种的典型花香和葡萄酒的典型果香起重要作用。本文检测到F4中萜类物质总量(736.09 μg/L)和单萜醇物质总量(584.05 μg/L)均为最高，F1两种物质总量次之 (632.24和370.59 μg/L)，而F3最低(470.22和332.09 μg/L)。

MENDES-FERREIRA等[22]的研究表明，Kloeckeraapiculata(科勒克尖端酵母，无性型为H.uvarum) 能够释放萜类物质。本文的研究表明， HBKS-Y3单菌发酵萜类物质含量相对降低(F3)，但其与HBKS-Y1混菌发酵萜类物质含量大大增加(F4)，表明混菌发酵过程中HBKS-Y3和HBKS-Y1之间产生了某种交互作用，增加了葡萄汁或者葡萄皮中萜类物质的释放，或者增加了科勒克尖端酵母释放萜类物质的量。葡萄皮中萜类化合物(单萜)的含量远高于葡萄汁中萜类化合物的含量[23]。因此，尽可能多地将葡萄皮中的结合态糖苷释放到葡萄汁中，结合酶的水解作用，将有助于改善葡萄酒的香气。

以上的研究结果表明，本土酵母发酵尤其是混菌发酵，在玫瑰香葡萄酒增香方面具有一定的优势，可以增加玫瑰香葡萄特征香气的含量，例如2-苯乙醇、单萜醇等。

2.4 感官分析

图3是4种酒样的感官评定结果。F1和F4的总接受度得分最高，但F4的花香和玫瑰香得分最高，F1次之。PIETROWSKI等[24]的报告表明S.cerevisiae与Hanseniaspora属酵母混菌发酵对提高苹果酒的花香有积极作用。本文HBKS-Y1和HBKS-Y3混菌发酵也得到类似的结果。证实了前人有关Hanseniaspora属和S.cerevisiae混菌发酵对葡萄酒风味的积极作用。此外本结果表明，HBKS-Y3单菌发酵 (F2)的花香并不突出，而且酸度过于突出，总接受度低。说明该野生NSC单菌发酵特性较差，更适合用于与S.cerevisiae混菌发酵。

图3 不同发酵酒样的感官评价Fig.3 Results of the sensory analysis of Muscat winesfrom different fermentations

3 结论

本试验对分离自玫瑰香葡萄自然发酵过程中的野生S.cerevisiae(HBKS-Y1)和野生H.uvarum(HBKS-Y3)的混菌发酵过程及其对玫瑰香葡萄酒香气的影响进行了分析。发现2株野生酵母单菌及混菌时均能单独完成发酵，但对葡萄酒的理化指标、香气成分和感官影响不同。HBKS-Y3单菌发酵，酒精度低，挥发酸含量高，乙酸乙酯含量也较高，感官评价得分最低；混菌发酵时HBKS-Y1和HBKS-Y3存在交互作用，使HBKS-Y1高级醇产量降低，同时抑制了HBKS-Y3的产酯和产酸能力，更重要的是两者混菌发酵提高了玫瑰香葡萄酒典型特征香气成分2-苯乙醇、萜烯类物质及单萜醇的含量。此外，混菌发酵酒样感官评定总接受度与商用酿酒酵母FX10相当，但花香和玫瑰香香气得分更高，感官评定结果和香气成分分析具有一致性。以上结果说明，HBKS-Y1和HBKS-Y3的混菌发酵有利于突出玫瑰香葡萄酒的品种香气特征。