β-胡萝卜素模拟体系超声降解机制研究

于奉生，孙志高，方明，马亚琴，盛冉

1(西南大学 柑桔研究所，重庆，400712) 2(鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂，276000)

类胡萝卜素是对以类异戊二烯为基本单元构成的类萜化合物及其衍生物的总称，柑橘汁中富含类胡萝卜素，它们不仅对果汁感官品质影响极大，而且也是重要的功能性成分，具有清除自由基、抗癌、抗肿瘤、降血脂、预防骨质疏松症及增强机体免疫力等多种生理功能[1]。由于人体自身不能合成类胡萝卜素，食用水果和蔬菜是其主要来源，故富含类胡萝卜素的柑橘汁受到研究者和消费者的广泛关注[2]。

杀菌处理能有效杀灭有害微生物、钝化酶活性和延长货架期，是柑橘汁加工最为关键的环节之一。传统巴氏杀菌虽能达到良好的杀菌效果，但对柑橘汁中类胡萝卜素含量的影响较大。超声杀菌作为一种新型非热杀菌技术，既可达到杀菌效果，又能最大限度地保存果汁中的营养成分，因此逐渐受到广泛关注和研究。相比于传统的热杀菌，超声杀菌虽然能减少柑橘汁中类胡萝卜素等热敏性物质的损失，但类胡萝卜素在超声过程中，受超声功率、超声温度等外源因子影响较大，此外，柑橘汁中的糖、酸、Vc等内源因子也会对其降解产生重要的影响[3-5]。

柑橘汁中的类胡萝卜素存在于果汁的水相体系中，因此研究水相体系中类胡萝卜素的降解能更好地反映出其在超声过程中的降解规律及降解机制。本实验选取β-胡萝卜素代表类胡萝卜素，构建β-胡萝卜素水相模拟体系，考察超声作用下南丰蜜桔汁模拟体系中糖、酸、Vc等内源因子对类胡萝卜素的影响；建立降解动力学模型，探究β-胡萝卜素在不同超声功率、温度、时间等外源因子下的降解规律，对其降解产物进行鉴定，从而了解各因子对类胡萝卜素降解的具体影响，探究其在超声过程中的降解规律及降解机制，对有效防止其在超声杀菌过程中的损失具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-胡萝卜素(纯度≥96.0%)，上海源叶生物科技公司；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether, MTBE)、四氢呋喃(均为色谱纯)，美国Sigma公司；丙酮、乙醚、KOH、NaOH(均为分析纯)，重庆川东化工有限公司；2,6-二叔丁基对甲酚(butylated hydroxytoluene, BHT)、吐温-80、柠檬酸、KBr(均为分析纯)，成都科龙化工试剂厂；抗坏血酸、葡萄糖、果糖、蔗糖(纯度均≥99.0%)，北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DP-800超声波清洗器，上海生析超声仪器有限公司；LD-915恒温槽，宁波天恒仪器厂；TTL-DCI氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Ultimate3000高效液相色谱仪，戴安中国有限公司；Shodex RI-101示差折光检测器，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Prestige-21傅里叶光谱扫描仪，日本岛津公司；7890B/5977A气相色谱-单四级杆质谱联用仪、DB-5MS石英毛细管柱，美国Agilent公司；顶空固相微萃取操作台、手动顶空固相微萃取进样器，美国Supelco公司；L-550台式低速大容量离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 β-胡萝卜素水相体系的构建

参照王树林[6]的方法，略有修改，具体如下：称取5.0 mg β-胡萝卜素用10.0 mL二氯甲烷溶解，然后用1.0 g吐温-80乳化，避光条件下将二氯甲烷液氮吹干，用100 mL蒸馏水将其溶解成质量浓度为50 mg/L的β-胡萝卜素水相储备液。

1.3.2 南丰蜜桔汁中类胡萝卜素、糖、酸、Vc的含量测定

1.3.2.1 类胡萝卜素的测定

参照PUPIN等[7]和陶俊等[8]的方法，略有修改，具体如下：取10 mL柑橘汁，加入适量含1 g/L抗氧化剂BHT的丙酮提取，充分振荡，使其充分混合，然后在4 000 r/min离心10 min，将沉淀再用含1 g/L BHT 的丙酮继续提取2～3次，直至沉淀无色，将滤液在35 ℃下真空旋转蒸发至干；用乙醚(含1 g/L BHT)复溶，加100 g/L KOH-甲醇溶液(含1 g/L BHT)，置于暗处皂化反应3 h，加入100 g/L NaCl 使之分层萃取，水相再用乙醚(含1 g/L BHT)二次萃取，合并乙醚相，用蒸馏水反复洗至中性，用无水Na2SO4干燥，过滤，滤液在35 ℃下真空旋转蒸发至干，用V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=1∶1混合液定容至2 mL棕色瓶中，置于-18 ℃冰箱中备用，上样前用0.22 μm微孔滤膜过滤。

类胡萝卜素的HPLC条件为：流动相：A为水, B为甲醇，C为MTBE。0 min 5%(体积分数，下同)A，90%B，5%C；12 min 95%B，5%C；25 min 89%B，11%C；40 min 75%B，25%C；60 min 50%B，50%C；62 min 5%A，90%B，5%C。色谱柱YMC C30(4.6 mm×250 mm，5μm)，检测波长450 nm，柱温为40 ℃, 进样量20 μL，流速为1.0 mL/min，B和C均含有1 g/L BHT。

1.3.2.2 葡萄糖、果糖、蔗糖的测定

参照葛宝坤等[9]的方法，略有修改，采用高效液相色谱法，检测器为示差折光检测器。具体条件：流动相：85%乙腈，色谱柱：Phenomenex Luna NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为40 ℃，检测池40 ℃，进样量10 μL，流速为2 mL/min。

1.3.2.3 可滴定酸的测定

参照GB/T 8210—2011《柑桔鲜果检验方法》中的指示剂法测定[10]。准确吸取25 mL果汁样品，蒸馏水稀释至250 mL后摇匀。将10 mL稀释后的果汁置于150 mL锥形瓶中，加入2～3滴10 g/L的酚酞，然后用已经标定的NaOH溶液滴定至微红色且30 s不褪色。

1.3.2.4 Vc的测定

参照GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸》中的2，6—二氯靛酚滴定法[11]。

1.3.3 南丰蜜桔汁模拟体系的超声处理

将配制好的11组南丰蜜桔汁模拟体系分别在超声杀菌条件(超声功率720 W、超声温度50 ℃、超声时间36 min)下处理后，对各体系中β-胡萝卜素的含量进行检测，每组重复处理3次。

1.3.4 β-胡萝卜素水相模拟体系降解动力学模型的构建

将配制好的β-胡萝卜素水相模拟体系在不同超声温度(30、40、50、60、70 ℃，720 W)和不同超声功率(180、360、540、720、900 W，50 ℃)下分别处理10、20、30、40、50、60 min，检测β-胡萝卜素的含量，每组重复处理3次，建立β-胡萝卜素水相模拟体系在不同超声温度及不同超声功率下的降解动力学模型。应用试错法假设反应级数分别为零、一、二时，根据其相应的动力学模型反应物浓度(C)与时间(t)、反应物浓度的对数(lnC)与时间(t)、反应物浓度倒数(1/C)与时间(t)应该为线性关系，相关系数(R2)最高的模型即为其降解动力学模型。零级，一级，二级模型分别如公式(1)(2)(3)所示：

(1)

(2)

(3)

式中：C，反应物在给定时间的质量浓度,mg/L；C0，为反应物的初始质量浓度,mg/L；k，速率常数；t，超声时间,min。

1.3.5 β-胡萝卜素水相模拟体系降解产物的鉴定

1.3.5.1 异构体的鉴定

采用高效液相色谱-二极管阵列检测法(high performance liquid chromatography-diode array detection, HPLC-DAD)分析经超声处理后的β-胡萝卜素的异构产物，使用DAD扫描了250～550 nm范围内的异构体的紫外可见光谱，根据光谱特征及色谱行为对其进行鉴定。具体液相条件：流动相A为V(乙腈)∶V(甲醇)=70∶30, B为MTBE；B的体积分数在20 min内由0%增加到80%；色谱柱YMC C30(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长460 nm，柱温为40 ℃, 进样量20 μL，流速为1.0 mL/min，A和B均含有0.1% BHT。

1.3.5.2 氧化产物的鉴定

经超声处理的β-胡萝卜素经KBr压片法处理后，采用傅里叶红外光谱扫描，分析其官能团的变化。

1.3.5.3 挥发性产物的鉴定

色谱条件：色谱柱DB-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：起始温度40 ℃，保持2.5 min，再以5 ℃/min升至200 ℃，保持10 min；进样口温度230 ℃，不分流进样，载气(He)流速1.5 mL/min。

质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，质量扫描范围m/z40～400。

1.3.6 数据处理

所有实验测得的数据都以3个重复的“平均值±标准差”表示，采用Excel进行数据处理，Origin 9.0绘制实验结果图。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素水相体系的构建

β-胡萝卜素水相体系的紫外光谱扫描曲线如图1所示，发现其在水及四氢呋喃中的特征吸收曲线具有相同的特征吸收峰，且均在460 nm处有最大的吸光值，因此水相体系中β-胡萝卜素的含量可直接用分光光度法来测定其吸光值，根据吸光值的大小来计算其浓度。

图2是超声过程中β-胡萝卜素在水及四氢呋喃中的降解趋势，其降解趋势存在显著差异，原因主要是超声的空化效应与溶剂的表面张力、黏度及饱和蒸汽压等物理特性有关，其中溶剂的饱和蒸汽压对超声空化效应影响最大,饱和蒸汽压越高，空化效应越弱[12]。相比四氢呋喃，水的饱和蒸气压低，因此水相体系中的空化效应较强，更能反映类胡萝卜素在柑橘汁中的存在状态。

图1 β-胡萝卜素在水相体系和四氢呋喃中的典型吸收曲线Fig.1 Absorption profile of β-carotene in aqueoussolution and tetrahydrofuran

图2 超声过程中β-胡萝卜素在水相体系和四氢呋喃中的降解趋势Fig.2 Degradation trend of β-carotene in aqueoussolution and tetrahydrofuran during ultrasound treatment

2.2 内源因子的影响

2.2.1 南丰蜜桔汁模拟体系的构建

通过检测得到南丰蜜桔汁中各物质的质量浓度：葡萄糖(glucose，G)19.3 g/L、果糖(fructose,F)20.2 g/L、蔗糖(sucrose,S)60.6 g/L、柠檬酸(citric acid，CA)5.9 g/L、Vc 141.9 mg/L。根据检测结果，分别设计含有各单糖及总糖、酸、Vc的模拟体系，然后进行配制，11组模拟体系的具体构成见表1。

表1 模拟体系中β-胡萝卜素、糖、酸、Vc的添加量Table 1 Fortified content of β-carotene,sugars,citricacid and Vc in various model systems

续表1

2.2.2 各内源因子对类胡萝卜素降解的影响

配制好的11组南丰蜜桔汁模拟体系分别经超声杀菌(超声功率720 W、超声温度50 ℃、超声时间36 min)处理后，其β-胡萝卜素的含量如图3所示，通过对各组β-胡萝卜素含量的比较可以发现各内源因子及其协同作用对类胡萝卜素降解的影响。

图3 超声处理后不同模拟体系β-胡萝卜素含量Fig.3 Content of β-carotene in various modelsystems after ultrasound treatment

对照组1中β-胡萝卜素降解了30.21%，在2组和7组分别添加Vc和柠檬酸，其降解率分别为36.46%和44.79%，说明二者均能促进类胡萝卜素的降解，而8组损失了53.13%，证明二者共同存在对降解有增效作用。孙明奇等[13]研究了柑橘皮粉类胡萝卜素提取液在不同条件下的稳定性，结果表明酸性条件下类胡萝卜素的保存率较低，柠檬酸等酸味剂也有促降解的效果。此外，Vc能还原活性氧产生较多的羟基自由基，起到促氧化的作用，从而使类胡萝卜素发生降解[4]。

4组、5组和6组中分别添加葡萄糖、蔗糖、果糖，其降解率分别为27.08%、21.88%、26.04%，添加了3种糖的3组降解率为14.58%，究其原因可能是糖通过降低体系中的水分活度及溶解氧，进而对类胡萝卜素的降解有保护作用[5]。9组、10组分别为β-胡萝卜素-糖-Vc和β-胡萝卜素-糖-酸体系，降解率分别为25.00%和35.42%，说明糖能阻止Vc和酸对类胡萝卜素的破坏，但在降解过程中，9组中主导的是糖对降解的保护作用，10组中主导的是酸对降解的促进作用。11组为添加了糖、酸、Vc的类胡萝卜素模拟体系，该体系的降解率为39.58%，比9组和10组高，而比8组低，也能说明超声处理过程中，酸和Vc能促进类胡萝卜素降解，而糖对其有一定的保护作用。

2.3 降解动力学的建立

2.3.1 不同超声温度降解动力学的建立

依据试错法得到不同超声温度下β-胡萝卜素的降解动力学模型如图4所示，其动力学方程及决定系数见表2，30 ℃时β-胡萝卜素的降解符合零级动力学模型，40～70 ℃时符合一级动力学模型，如表2所示。

图4 不同超声温度下β-胡萝卜素降解动力学曲线Fig.4 Degradation kinetics curve of β-caroteneunder different ultrasound temperatures

表2 不同超声温度下β-胡萝卜素降解反应级数、动力学方程、反应系数、决定系数和半衰期Table 2 Degradation reaction order，kinetic equations，k，R2 and t1/2 of β-carotene under differentultrasound temperatures

温度/℃反应级数线性方程k/(min-1)(P<0.05)R2(P<0.05)t1/2/min300y=-0.042 5x+0.203 60.042 50.910 6122.438401y=-0.00 6x-0.040 50.006 00.925 0108.775501y=-0.00 9x-0.049 90.009 00.958 871.472601y=-0.014x-0.021 70.001 40.947 547.961701y=-0.024 9x-0.021 40.024 90.975 526.978

注：40、50、60、70 ℃在主坐标轴，30 ℃在次坐标轴

基于动力学模型计算出不同超声温度下的反应系数及半衰期，从而可以看出随着温度的升高降解率也随着上升。孙玉敬[14]研究-5～35 ℃下超声处理全反式β-胡萝卜素的二氯甲烷溶液，结果随着温度的升高降解率下降，与本实验结果存在差异。可能的原因是在-5～35 ℃的低温下，超声的空化效应在降解的过程中起主导作用，二氯甲烷的饱和蒸汽压随着温度的升高而升高，从而空化效应减弱，使得β-胡萝卜素的降解率也随之降低。本实验的温度较高且是在水相体系中进行的，热效应是在降解过程中起主导作用，因此降解率会随温度升高而上升。

处理条件不同，类胡萝卜素的降解动力学模型也会有所差异。SUN等[15]发现β-胡萝卜素的降解在低温下符合一级动力学模型，在25 ℃符合二级动力学模型。此外，热处理条件下β-胡萝卜素的降解符合零级动力学模型，而在光处理下又符合一级动力学模型[16]。

2.3.2 不同超声功率降解动力学的建立

不同超声功率下β-胡萝卜素的降解动力学模型如图5所示，其动力学方程及决定系数见表3。

图5 不同超声功率下β-胡萝卜素降解动力学曲线Fig.5 Degradation kinetics curve of β-caroteneunder different ultrasound power

表3 不同超声功率下β-胡萝卜素降解反应级数、动力学方程、反应系数、决定系数、半衰期Table 3 Degradation reaction order，kinetic equations，k，R2 and t1/2 of β-carotene under differentultrasound power

超声功率/W反应级数线性方程k/(min-1)(P<0.05)R2(P<0.05)t1/2/min1801y=-0.005 7x-0.049 40.005 70.892 2112.9383601y=-0.008 3x-0.036 40.008 30.914 279.1265401y=-0.013x-0.078 50.0130.926 747.2817201y=-0.009x-0.049 90.0090.958 871.4729001y=-0.010 6x-0.050 60.010 60.915 660.618

180～900 W时β-胡萝卜素的降解均符合一级动力学模型。不同超声功率下的反应系数及半衰期如表3所示，在本实验的功率范围内，降解率先升高后降低然后接近平衡，540 W时降解率最大。可能的原因是在180～540 W范围内，超声空化效应随超声功率的提高而增强，当功率超过540 W时产生的空化气泡过大来不及破裂，即使破裂产生的爆破强度也不高，同时过多地空化气泡会引起超声波的散射，阻碍超声波的传播，导致降解率下降。而当功率超过720 W时，导致降解率不再降低的原因可能是，较高的超声功率产生的热量无法在短时间内得到释放，这些热量也可能引发类胡萝卜素的降解。

本实验是在超声活性区域建立的β-胡萝卜素的降解动力学模型，该区域具有较强的超声空化效应，同时存在动态变化以及不均一性的超声化学效应，此外它们与热效应相互叠加，使得不稳定的类胡萝卜素的降解动力学模型较为复杂。

2.4 异构体的鉴定

2.4.1 异构体的定性鉴定

经过不同条件超声处理的β-胡萝卜素会产生不同的异构体，采用HPLC-DAD对其进行分离及鉴定，图6-B为超声功率720 W，超声温度 50 ℃下产生的3种异构体，即峰1、2、4。

A-β-胡萝卜素标准品;B-超声处理后的β-胡萝卜素图6 β-胡萝卜素高效液相色谱图Fig.6 HPLC figure of β-carotenes

图7即为峰1、2、4对应的紫外可见光谱。全反式β-胡萝卜素仅在460 nm左右有一个“三指形”吸收峰，而其顺式异构体除了主要吸收峰之外，还在330～340 nm处出现一个吸收峰，即“顺式峰”，此顺式峰吸光度和主吸收峰吸光度的比值，即为Q值。根据此Q值和相关文献报道来对异构体进行判断，经判断峰1、2、4分别为15-顺式、13-顺式和9-顺式β-胡萝卜素，具体见表4。

图7 超声处理后β-胡萝卜素及其异构体的光谱特征图Fig.7 Spectral overlays of β-carotene and its isomersafter ultrasound treatment注：1、2、4在主坐标轴，3在次坐标轴

2.4.2 异构体的定量鉴定

因全反式构型的热力学更为稳定，因此类胡萝卜素主要以全反式的形式存在，顺反异构体在许多物化性质上存在差异，比如顺式异构体颜色的明亮度或饱和度较低，熔点较低，吸光系数较小以及热力学不稳定等。不同超声条件下生成的异构体含量如图8所示，图8-A显示不同超声温度下，3种异构体的含量先随温度上升而升高，50 ℃之后温度过高，在超声及热效应的共同作用下，导致生成的异构体降解，因此异构体的含量随温度升高而下降。图8-B显示不同超声功率下，3种异构体的含量随功率上升而升高，720 W之后功率过高，导致异构体的含量不再升高甚至下降。

表4 β-胡萝卜素异构体的鉴定Table 4 Identification of β-carotene isomers

注：a以正己烷为流动相；b梯度洗脱，V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=84∶14∶2和二氯甲烷(体积比从 80∶20 到 45∶55)；c梯度洗脱，V(甲醇)∶V(异丙醇)=99∶1和二氯甲烷(体积比从100∶0到70∶30)；d梯度洗脱，V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=84∶14∶2和二氯甲烷(体积比从100∶0到45∶55)[17-20]

A-不同超声温度;B-不同超声功率图8 不同超声条件下β-胡萝卜素异构体含量Fig.8 The contents of β-carotene isomers under differentultrasound conditions注：13-顺式、9-顺式在主坐标轴，15-顺式在次坐标轴

2.5 氧化产物的鉴定

图9 β-胡萝卜素红外光谱图Fig.9 FTIR spectra of β-carotene

2.6 挥发性产物的鉴定

超声处理后β-胡萝卜素降解产生的挥发性产物采用GC-MS进行分析，其总离子流图见图10，这些挥发性产物的详细介绍如表5所示，其中β-紫罗兰酮相对含量最高(27.73%)，其次是异佛尔酮(15.15%)、2,2,6-三甲基环己酮 (8.31%)、3-己醇(6.18%)、β-环柠檬醛(5.92%)；此外还有3,5,5-三甲基-2-环己烯-1-醇(2.41%)等降异戊二烯化合物。这些挥发性物质不仅具有特殊的香气，影响柑橘汁的风味，还具有多种生物活性功能，比如β-紫罗兰酮不仅能降低血脂，还能抑制癌细胞、调控体内癌细胞增殖[22]。

图10 β-胡萝卜素降解产物的GC-MS总离子流图Fig.10 Total ion current chromatograms of volatilecompounds of β-carotene degradation

表5 β-胡萝卜素水相体系中的挥发性成分Table 5 Volatile compounds of β-carotene in pure aqueous

续表5

序号保留时间/min化合物分子式相对含量/%1929.61萘 naphthaleneC10H81.062029.88β-紫罗兰酮 beta-iononeC13H20O27.732130.065,6-环氧-β-紫罗兰酮 5,6-epoxy-beta-iononeC12H20O20.912232.024-(2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4,1,0]庚-1-基)-3-丁烯-2-酮4-(2,2,6-trimethyl-7-oxabic yclo[4.1.0]hept-1-yl)-3-buten-2-oneC13H20O21.632337.11十六烷 hexadecaneC16H341.32

3 结论

(1)选用β-胡萝卜素代表类胡萝卜素，构建其水相模拟体系。通过测定南丰蜜桔果汁中糖、酸、Vc含量，配制11组模拟体系来探究各内源因子及其协同作用对类胡萝卜素降解的影响。超声处理过程中，Vc和柠檬酸均能促进类胡萝卜素降解，且二者共存时具有增效作用；糖对类胡萝卜素有一定的保护作用，能不同程度地阻止Vc和酸对类胡萝卜素的破坏。

(2)分别建立不同超声温度和超声功率下β-胡萝卜素的降解动力学，发现只有30 ℃时符合零级动力学模型，其余条件下均符合一级动力学模型，但其降解规律及降解机制存在差异。不同超声温度下，降解率随着温度的升高而上升，主要是热效应所致；不同超声功率下，降解率是先升高后降低，然后接近平衡，540 W时降解率最大，主要是超声空化效应所致。