血浆长链非编码RNA AFAP1-AS1和SOX2OT的表达对非小细胞肺癌的诊断价值

王志鹏， 李坚， 袁荣霞， 汪毅

(江苏大学附属医院 1. 呼吸内科， 2. 中心实验室， 江苏 镇江 212001)

肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其总的5年生存率约为15%[1]，其中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者约占85%[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。研究证实，lncRNAs在肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种类型的肿瘤细胞中表达异常，起促癌或抑癌作用[3]。近年来研究表明，多种lncRNAs可作为预测NSCLC预后的潜在生物标志物，例如lncRNA PVT1[4]、lncRNA H19[5]和lncRNA CCHE1[6]等。肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(actin filament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1)是从AFAP1编码基因位点的反义DNA链衍生而来，其在结直肠癌[7]、乳腺癌[8]以及胆囊癌[9]组织中表达上调。Yin等[10]报道，lncRNA AFAP1-AS1通过表观抑制p21表达来调控NSCLC细胞增殖，且其高表达预示NSCLC患者预后不佳。Y染色体性别决定基因簇2重叠转录本(sex-determining region of Y chromosome-box2 overlapping transcript，SOX2OT)是一个在多种疾病中呈异常表达的lncRNA，在肿瘤进展中起重要调控作用[11]，在胃癌[12]、肝细胞癌[13]以及结直肠癌[14]等组织中呈高表达。Hou等[15]研究指出，lncRNA SOX2OT调控肺癌细胞增殖生长，是预测肺癌患者预后不良的标志物。但是，血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT是否可用于诊断NSCLC尚不完全清楚。为此，本研究以NSCLC患者和良性肺病患者为研究对象，通过荧光定量PCR方法检测血浆中lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT相对表达量，探讨二者诊断NSCLC的可行性及临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 入组病例

选择2017年1月至2019年2月江苏大学附属医院呼吸内科NSCLC患者，共48例；另选取同期住院的良性肺病患者48例作为对照组，其中，社区获得性肺炎15例，慢性阻塞性肺疾病13例，间质性肺病8例，结核性胸膜炎7例，支气管哮喘5例。所有NSCLC患者均根据病理组织学结果确定诊断，均未接受过任何治疗。患者年龄、性别、临床分期、吸烟史、淋巴结转移等临床资料由病历获得。

患者均签署书面知情同意书。本研究符合人体试验伦理学标准，并获得医院伦理委员会批准。

1.2 全血标本采集与血清癌胚抗原测定

抽取受试者空腹肘正中静脉全血2 mL于EDTA抗凝管中，于30 min内行如下处理：4 ℃行3 000 r/min离心10 min，提取血浆500 μL，用1.5 mL无RNA酶的EP管进行分装，冻存于-70 ℃备用。同时，留取每位入组患者的2 mL血液标本于促凝管中，送至本院核医学科，采用微粒子免疫发光测定法检测血清癌胚抗原水平。根据试剂盒说明书标明的癌胚抗原正常上限设为5 μg/L。

1.3 主要试剂和仪器

Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)；氯仿、异丙醇、75%乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 总RNA提取与反转录

将“1.2”中标本常温解冻，加600 μL Trizol，振荡；加200 μL氯仿，振荡；4 ℃ 12 000×g离心15 min；吸取上层水相，加入水相等量异丙醇冰浴15 min，沉淀总RNA；4 ℃ 12 000×g离心10 min；取沉淀，75%乙醇洗涤2次；60 ℃孵育10 min；加入DEPC水充分溶解；测定RNA纯度，[D(260 mm)/D(280 mm)]=1.8～2.0为合格可用标本，按反转录试剂盒说明书将试剂和总RNA配置成20 μL反应体系(此过程均在冰上进行)。设置逆转录仪反应程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃随机。反应结束后，将标本cDNA于-20 ℃保存备用。

1.5 实时荧光定量PCR检测血浆中lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT的表达

按说明书将试剂和cDNA配置成20 μL反应体系(此过程均在冰上进行)。设置实时荧光定量PCR仪反应程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40个循环记录CT值，采用2-ΔΔCt方法计算lncRNA的相对表达量。选择5S rRNA作为内参基因。目的基因和内参基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。见表1。

表1 基因引物序列

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达水平

由图1可见，NSCLC患者血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT水平明显高于良性对照组(t=6.236，5.680，P均<0.01)。

图1 NSCLC患者和良性对照者血浆中lncRNAAFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达水平比较

2.2 NSCLC患者血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT水平与临床病理特征的关系

结果显示，血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT水平与NSCLC患者的肿瘤病理组织学类型明显相关，肺腺癌患者血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达水平均明显高于肺鳞状细胞癌患者(t=2.067，2.717，P均<0.05，图2)；而与患者性别、年龄、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移情况和吸烟史等临床病理特征均无明显相关(P均>0.05)，见表2。

图2 肺腺癌患者与鳞状细胞癌患者血浆中lncRNAAFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达水平比较

表2 NSCLC患者血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达水平与临床病理特征的关系

2.3 血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达诊断NSCLC效能的评价

如图3所示，lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT诊断NSCLC的AUC值分别为0.875 (95%CI： 0.804～0.947，P<0.05)和0.787 (95%CI: 0.691～0.883，P<0.05)，相似于血清癌胚抗原诊断NSCLC的AUC值(0.836, 95%CI： 0.752～0.908，P<0.05)。二者联合诊断NSCLC的AUC为0.901(95%CI: 0.832～0.968，P<0.05)，再联合血清癌胚抗原诊断NSCLC的AUC为0.914(95%CI： 0.849～0.978，P<0.05)，均高于其单独检测。见图3。

由表3结果显示，血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT诊断NSCLC的敏感性(87.4%、73.0%)、特异性(86.2%、81.9%)及准确度(84.3%、78.6%)与血清癌胚抗原相似，二者联合可提高诊断效能，再联合血清癌胚抗原可进一步增高诊断的敏感性(91.2%)、特异性(94.1%)和准确度(94.8%)。

图3 各指标单独及联合检测诊断非小细胞肺癌的ROC曲线

表3 lncRNA AFAP1-AS1，lncRNA SOX2OT和癌胚抗原单独和联合诊断NSCLC的效能

3 讨论

本研究结果显示，NSCLC患者血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT的表达水平显著高于良性肺病患者(P< 0.01)，同时ROC曲线分析结果显示，血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT鉴别NSCLC和良性肺病的AUC分别为0.875和0.787，与经典的肿瘤标志物癌胚抗原诊断NSCLC的AUC相似。上述结果说明，lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT可作为诊断NSCLC的生物标志物。

联合检测多项生物标志物可提高诊断肿瘤的准确性[16]，Xie等[17]研究显示，lncRNA SOX2OT在NSCLC组织以及患者血清标本中表达明显上调，血清lncRNA SOX2OT测定诊断NSCLC的AUC是0.745，将其与另一个lncRNA(ANRIL)及癌胚抗原、细胞角蛋白19、鳞癌抗原等三个血清肿瘤标志物联合获得的AUC为0.853。Tong等[18]发现，食管癌患者血浆lncRNA POU3F3诊断食管癌的AUC达0.842，其与血清鳞状细胞癌抗原结合可使AUC升高至0.926，二者联合也能有效地诊断早期食管癌。本研究表明，通过联合检测血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT以及再联合血清癌胚抗原可进一步提高诊断NSCLC的AUC。血浆lncRNA AFAP1-AS1诊断NSCLC的总体效果稍优于癌胚抗原，但是lncRNA SOX2OT的敏感性与特异性略逊于癌胚抗原。然而，血浆lncRNA AFAP1-AS1与lncRNA SOX2OT联合可提高诊断的准确性，再结合血清癌胚抗原可进一步增高诊断效能。由此证实，多项生物标志物联合检测可提高诊断NSCLC效能，当暂时难以或无法获取组织标本确定诊断时，可通过联合检测lncRNA AFAP1-AS1、lncRNA SOX2OT以及癌胚抗原水平辅助诊疗。

先前Deng等[19]研究发现，NSCLC患者肿瘤组织中lncRNA AFAP1-AS1表达量明显高于癌旁组织，NSCLC患者lncRNA AFAP1-AS1表达与患者临床分期、吸烟史、淋巴结转移和远处转移有关，而与患者性别和年龄无关。另有研究[20]表明，NSCLC患者血液lncRNA GAS5表达下调，lncRNA SOX2OT表达上调，并均与NSCLC患者临床分期相关。本研究结果显示，血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达水平均与肿瘤的病理组织学类型显著相关，腺癌患者中二者表达水平明显高于鳞癌患者，而与患者其他临床病理特征均无明显相关性。其原因可能由于入选病例的各个临床分期、各种组织学类型及有无淋巴结转移的患者比例不同，以及检测lncRNA表达的样本类型不同。此外，血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT表达水平与NSCLC患者临床分期无明显相关性，表明早期(Ⅰ～Ⅱ期)和中晚期(Ⅲ～Ⅳ期)NSCLC的血浆lncRNAs水平有相似的增高，提示二者对早期NSCLC的诊断效能与中晚期NSCLC相似。

综上所述，本研究显示血浆lncRNA AFAP1-AS1和lncRNA SOX2OT可作为生物标志物用于NSCLC的诊断，二者与血清癌胚抗原联合检测能够获得较高的诊断敏感性和特异性。