基于鱼体和耳石形态的东海两种鲐属鱼类判别分析

韩霈武,陈新军, 3, 4, 5, 6,方 舟, 3, 4, 5, 6,张 衡

(1.上海海洋大学海洋科学学院，上海 201306； 2. 中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090；3.大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室，上海 201306； 4.国家远洋渔业工程技术研究中心，上海 201306； 5.农业农村部大洋渔业开发重点实验室，上海 201306; 6. 农业农村部大洋渔业资源环境科学观测实验站，上海 201306)

鲐属(Scomber)鱼类隶属于鲈形目(Perciforms)，鲭科(Scombridae)，是重要的中上层经济性鱼类，主要分布于太平洋、大西洋和印度洋温带及其邻近海域[1-2]。我国拥有丰富的鲐属鱼类资源，从20世纪50年代初期就开始利用灯光围网捕捞鲐属鱼类，20世纪80年代，我国近海底层传统经济鱼类资源逐渐衰退，到90年代后期，鲐属鱼类已经成为我国近海主要的经济鱼类之一，年产量约为30万t[3-4]。在我国近海分布的鲐属鱼类主要有两种：日本鲭(S.japonicus)与澳洲鲐(S.australasicus)。日本鲭与澳洲鲐在形态特征和生物学特性上非常相似，并且它们的洄游路线以及分布范围存在重叠，这导致二者在分类上存在着许多争议[5-7]。目前，可以根据腹部是否存在小黑斑点及背鳍鳍条数目来鉴别日本鲭与澳洲鲐，即：日本鲭第一背鳍鳍棘9～10根，体腹部银白色，一般无斑点；澳洲鲐第一背鳍鳍棘11～12根，体腹部密布不规则形小蓝黑斑。但是时常由于腹部斑点分布的不均匀和背鳍鳍条的损伤，影响到外观形态上的区分结果。

种类和种群的鉴别是进行渔业资源评估管理的基本前提[8]。形态学方法的特点是快捷简便、容易掌握、操作简单等，因此广泛应用于多种物种的鉴定。最常见的方法是通过外形测定来进行差异分析，但以往传统形态测量法会产生较大的误差，同时所测量的数据也无法全面地反映鱼类的几何形态学信息[9]。框架法(truss)兼有测量形态和几何形态的优点，它利用鱼体的形态特征，在鱼体轮廓边缘选取一定数量的点，根据这些点连接成线，可以把鱼体划分为多个部分，从而能更全面的包含关于鱼体形状变化的信息，因此广泛应用于各种研究中[10-11]。耳石是鱼类重要的硬组织，具有稳定的形态结构，同时也蕴含着重要的生态信息。目前针对耳石形态使用较为广泛的除了传统测量法外，傅立叶分析以其简单易懂和可模拟形态的特点，也得到科研工作者的青睐[12-14]。因此，本研究拟利用框架法和傅立叶分析，对两种鲐属鱼类的外形形态和耳石形态特征进行分析，利用判别分析法比较两者的正确率，以找到更优方法来有效区分两个种类，为鲐属鱼类资源评估的种类划分提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

本研究所采用的样本来自于东海海域(26°～28°N、122°～124°E)，此区域为鲐属鱼类的主要越冬场所，取样时间为2017年10月至2018年2月，此阶段鲐属鱼类基本在0～1龄，且大多处于成熟期。所有的样本经过冷冻后带回实验室进行解冻处理。本次样本共203尾，通过腹部斑点及背鳍鳍条数进行综合判断，确定其中日本鲭为83尾，澳洲鲐为120尾。样本基本情况见表1。实验过程中用镊子将矢耳石从平衡囊内取出，并用水清洗耳石，以去除其表面杂质，然后将其放入恒温烘箱中进行干燥，等待后续备用。

表1 两种鲐属鱼类的基本信息Tab.1 Sampling information of two Scomber species

1.2 实验方法

1.2.1 鱼体形态测量

用描述鱼体形态的框架结构系统在鱼体上建立框架。本研究共选定了13个解剖学坐标(anatomical landmark)，以便获取鲐属鱼类的框架结构。如图1所示，运用ImageJ软件，根据选定的13个解剖学坐标之间的直线距离，共测量出26个框架结构可量性状(精确到0.001 mm)。

图1 13个标点所构建的鲐属鱼类框架结构测量图[15]Fig.1 Locations of 13 landmarks for constructing the truss network of fish (filled circle) and morphometric lengths注：1.吻前端； 2.神经颅后侧面(后颈鳞片开始); 3.第一背鳍基部起点; 4.第一背鳍基部末端; 5.第二背鳍基部起点; 6.第二背鳍基部末端; 7.尾鳍背部起点; 8.椎骨柱的后端; 9.尾鳍腹部起点; 10.臀鳍基部末端; 11.臀鳍基部起点; 12.腹鳍基部起点; 13.上颌最后点Note ：1. anterior tip of snout; 2. most posterior aspect of neurocranium (beginning of scaled nape); 3. origin of the first dorsal fin; 4. end of first dorsal fin; 5. origin of second dorsal fin; 6. end of second dorsal fin; 7. dorsal origin of caudal fin; 8. posterior end of vertebrae column; 9. ventral origin of caudal fin; 10. end of anal fin; 11. origin of anal fin; 12. origin of ventral fin; 13. posteriormost point of maxillary

1.2.2 耳石图像获取及轮廓提取

将干燥后的耳石放入显微镜下进行观察，运用Olympus 光学显微镜的10倍镜头下的CCD软件进行拍照，所获得的图片用于进一步分析(图2)。本实验均选择左侧耳石的形态数据进行研究，若有左侧耳石丢失的情况，则选择右侧耳石替代。通过剔除破损严重的耳石，最终取得日本鲭耳石为71个，澳洲鲐为81个。

使用R程序中的“shapeR”加载包[16]对耳石目标进行轮廓提取，自动读取两鱼耳石轮廓数据，每个耳石轮廓被读取为连续的坐标点，共1 000个，这些坐标点通过一系列傅立叶分析方法最后以谐值的形式表现出耳石的轮廓。CAMPANA和CASSELMAN[17]认为20组傅立叶谐值就能较为完整地描述和模拟出耳石轮廓。因此，本研究选取20组傅立叶谐值，每组谐值由4个系数构成，这样每个耳石样本就能得到80个傅立叶系数。同时，由于傅立叶形态特征值对图形化耳石比较敏感(主要在位置、大小和方向等方面)，因此所得出的谐值需要经过标准化处理，才能应用于随后的数据分析中。在标准化的过程中每个耳石样本前3个系数值均为常数(A1=1，B1=C1=0) ， 这样每个耳石外部轮廓由77个傅立叶系数组成，此数据将进行后续逐步判别分析。

图2 两种鲐属鱼类耳石形态结构Fig.2 Morphology of otolith for two Scomber species注：A. 日本鲭；B. 澳洲鲐Note: A. S. japonicus; B. S.australasicus

1.3 数据分析

1.3.1 鱼体形态数据分析

1)形态分析应不受尺寸的影响，避免对结果的误解。因此，利用相对生长测定法[18](allometric method)对每条鱼的26个可量性状数据进行标准化处理：

Madj=M(Ls∕Lo)b

式中，Madj为可量性状标准化后的数据；M为各可量性状标准化前的数据；Ls为本样品叉长的平均值；Lo为各种类个体的叉长；b为每个样本的lgM对lgLo斜率。

2)t检验。运用R语言对两种鲐属鱼类的26个可量性状分别进行t检验，根据P值的大小来判断它们是否存在差异[11]。

3)逐步判别分析(stepwise discriminant analysis, SDA)。利用SPSS17.0软件中的逐步判别分析方法建立两种鲐属鱼类的判别公式：

判别准确率计算如下：

综合判别率计算如下：

式中，Pa为判别准确率;Pc为综合判别率;A是指该分组所测量的实际个体数;B是指被判为该分组的个体数;Ai是指第i个分组中判别正确的个体数;Bi是指第i个分组的实际个数;n为分组数。

1.3.2 耳石形态数据分析

首先将耳石外部轮廓所测得的77个系数用Levene’s法进行方差齐性检验，去除非齐性的参数，然后进行正态检验，随后将剩余的参数进行逐步判别分析(SDA)，挑出适合的因子，建立判别函数，并计算判别正确率和总的正确率，计算公式同上。

2 结果与分析

2.1 基于框架测量法的外形分析

2.1.1 两种鲐属鱼类可量性状的初步比较

表2列举了日本鲭与澳洲鲐经过标准化处理后的可量性状方面的实验结果，通过比较日本鲭与澳洲鲐的平均值，可以得出两种鱼类在4-5、11-12、1-12、3-11、3-10、4-11和4-10中的值相差较大(≥10.00)，且日本鲭的值均小于澳洲鲐的值；在7-8、8-9、10-11、13-1和7-9中的值相差较小(≤3.00)。

对26个可量性状进行t检验，结果表明，两种鱼类在10-11中差异不显著，在其余的可量性状中差异极显著。

2.1.2 基于外形参数对两种鲐属鱼类的判别分析

通过逐步判别分析进行分类，运用Wilks’Lambda法对26个可量性状进行筛选，最终选择了4个可量性状(1-2、10-11、2-11和3-11)来对两种鲐属鱼类进行分类。以这4个可量性状为自变量建立判别函数，具体如下：

日本鲭：

Y=2.895X1-0.051X2+2.029X3-0.237X4-187.301

澳洲鲐：

Y=3.125X1-0.248X2+2.279X3-0.051X4-248.182

将两种鲐属鱼类的可量性状分别代入上述判别函数中，得到两个函数值Y。其中判别函数中哪个函数值Y最大，则其对应的种类便是该样本所属的种类。从判别的结果来看，在初始判别中，日本鲭的判别正确率为85.40%，澳洲鲐的判别正确率为89.20%，总体正确率为87.60%。经过交叉验证得出的结果与初始判别结果近似，日本鲭与澳洲鲐的判别正确率分别为82.90%和88.30%，总体正确率为86.70%(表3)。

表2 日本鲭与澳洲鲐可量性状之间的比较Tab.2 Comparison of morphometric characteristics of S. japonicas and S. australasicus

注：P<0.01为差异极显著；P<0.05为差异显著；P>0.05为无显著差异

Note：P<0.01 means extremely significant differences；P<0.05 means significant differences；P>0.05 means no significant difference

2.2 傅里叶分析

2.2.1 耳石形态特征与重构

两个物种的平均耳石示意图如图3所示。两种鲐属鱼类耳石总体轮廓呈瓦状，耳石前端基叶长而尖，翼叶宽而短；耳石的背侧凹陷，腹侧则比较平直；耳石后端宽大，较为平滑。耳石前端比较开阔，中间窄，后端又逐渐变宽，达到最宽。

比较两种鲐属鱼类耳石，可以看出日本鲭与澳洲鲐的耳石形态存在一定的差异。其中，日本鲭的耳石略小于澳洲鲐，在耳石后端(0～90°和270～360°)尤为明显。澳洲鲐在耳石约30～60°和300～330°的部位，显得更为宽大(图3)。

图3 基于傅立叶分析的两种鲐属鱼类耳石模拟平均形态示意图Fig.3 Simulation of mean otolith morphology for two Scomber species based on Fourier analysis

2.2.2 判别分析

用逐步判别分析对两种鲐属鱼类进行分类，通过正态检验和方差齐性检验，将剩余入选的因子用Wilks’Lambda法进行筛选，最终选择了7个参数(V8、V20、V24、V25、V32、V37、V40)来对两种鲐属鱼类进行分类。以这7个参数为自变量建立判别函数，具体如下：

日本鲭：

Y=175.275×V8+4 613.253×V20+8 149.713×V24+4 349.258×V25+10 084.571×V32+7 846.587×V37+159 845.258×V40-2 910.117

澳洲鲐：

Y=220.534×V8+4 767.894×V20+8 199.587×V24+4 158.658×V25+10 254.627×V32+7 549.861×V37+160 158.439×V40-2 957.456

将两种鲐属鱼类样本所挑选出的傅里叶谐值分别代入上述判别函数中，得到两个函数值Y。其中判别函数中哪个函数值Y最大，则其对应的种类便是该样本所属的种类。从判别的结果来看，所得的总正确率均比框架测量法所得的总正确率高。在初始判别中，日本鲭的判别正确率为91.50%，澳洲鲐的判别正确率为93.80%，总体正确率为92.40%。经过交叉验证得出的结果与初始判别结果近似，日本鲭与澳洲鲐的判别正确率分别为87.30%和91.30%，总体正确率为90.20%(表4)。

3 讨论

3.1 可量性状初步比较分析

传统形态测量法对鱼体的形态描述主要是通过对鱼体的头部、尾部和横纵方向进行测量分析，但是这些测量并不能全面的包含关于鱼体形状变化的信息，因而不能有效地区分不同鱼类的形态差异[19-20]。而框架测量法则能克服这一缺点，利用鱼体的形态特征，在鱼体轮廓边缘选取一定数量的点，根据这些点连接成线，可以把鱼体划分为多个部分，从而更能全面的包含关于鱼体形状变化的信息。目前，海萨等[21]利用框架测量法对鲈属鱼类进行了研究，结果显示伊犁鲈(Percaschrenki)与黄金鲈(P.flavescens)和河鲈(P.fluviatilis)在形态上有较大的差距，从而表明了相对于传统形态测量法，框架测量法更加适用于鱼类的形态学研究；孟立霞[22]利用框架测量法对雅砻江5种裂腹鱼类进行形态学差异研究,结果表明这5种裂腹鱼类存在显著的形态学差异，可以被有效辨别，也证实了框架测量法的优越性。

表4 基于傅里叶分析的两种鲐属鱼类判别分析结果Tab.4 Result of classification between S. japonicas and S. australasicus based on Fourier analysis by SDA

唐启升[3]认为：每年春季，鲐鱼从东海南部的越冬场向浙江近海的产卵场做生殖洄游，性发育成熟的个体就地产卵，产卵结束后游向外海索饵，夏末秋初鲐鱼一般位于东海北部和黄海南部。而春季性腺未发育成熟的鲐鱼继续北上。春末夏初，鲐鱼进入黄海产卵，产卵结束后在当地索饵，度过夏季和秋季。秋末，鲐鱼南下洄游，冬季返回越冬场。本文采用框架测量法对东海南部的两种鲐属鱼类的形态差异进行研究，并利用相对生长测定法来对数据进行标准化，从而消除异速生长对结果的影响。研究表明，在26个可量性状数据的平均值中，有超过一半的数据在统计分析中存在差异，这些数据均表明日本鲭与澳洲鲐在形态上存在着明显的差异。在这些可量性状中，差异主要集中在鱼的头部与躯干部。日本鲭的头部和躯体部分均小于澳洲鲐。头部的差异可能是受到食性和摄食行为的影响[23]，鲐属鱼类具有鳃耙和牙齿，既可以摄食浮游动物又可以捕食鱼类等其他动物，但其摄食的种类及比重有所差异[4]。躯干部的差异有可能与游泳活动能力强弱相关，两种鲐属鱼类栖息水层的不同可能影响了它们的游泳能力。

对26个可量性状进行逐步判别分析，最终选定了4个可量性状来对两种鲐属鱼类进行分类。这4个可量性状包含了鱼的头部(1-2)和躯干(10-11、2-11、3-11)，从而对鲐属鱼类形态进行判别分析。从结果可以发现，利用框架测量法对两种鲐属鱼类进行判别分析是有效可行的。这一结果与邵峰等[24]对东黄海鲐属鱼类形态差异研究结果相符合。因此东海两种鲐属鱼类在形态上差异明显，且不同部位的差异也各有所不同。

3.2 傅里叶分析

耳石是鱼类在生长过程中沉积在内耳的结石，主要成分为碳酸钙，对鱼类声音接收和平衡定向起着重要的作用。随着鱼类的生长，耳石也不断地生长，且一旦形成一定的形状，就很少会发生吸收、变形和分解的现象，结构稳定，被广泛应用于不同种类的鱼类耳石形态鉴别中[25-29]。从形态上看，日本鲭的耳石与澳洲鲐的耳石存在着一定的差异，尤其是在耳石后端部分(图3)。目前针对耳石形态较为广泛使用的除了传统测量法外，傅立叶分析以其简单易懂和可模拟形态的特点，广泛应用于各种种类鉴别中。方舟等[12]利用传统形态测量法与傅立叶分析对西非沙丁鱼(Sardinapilchardus)和金色沙丁鱼(Sardinellaaurita)的耳石形态差异进行分析，结果能很好地对种类进行区分，并且发现傅立叶分析法更加准确、可靠。本研究是利用傅立叶分析对两种鲐属鱼类进行判别分析，从结果来看，初始判别的正确率大于90%，经交叉验证后，判别率略微减少，但也高于85%。初始判别分析与交叉验证的总正确率近似，均大于90%。

由此可见，利用框架测量法对两种鲐属鱼类的判别分析与耳石的傅立叶分析结果一致，均表明日本鲭与澳洲鲐差异明显。值得一提的是，利用傅立叶分析得出的判别总正确率比基于框架测量法的判别总正确率提高了3%～5%，这可能是由于鱼体在捕捞、运输过程中受到一定的损坏，而耳石是在鱼体内部，结构稳定，不易遭到破坏，这也说明了耳石作为判别材料的可靠性。

4 小结

本文采取框架法对鱼体形态进行判别分析，再采取耳石的傅立叶分析进行验证，结果表明这两种方法都适用于鲐属鱼类鉴别，同时傅立叶方法对耳石的判别分析比框架测量法在判别正确率上有所提升，说明耳石傅立叶分析可以更好地用于鱼类种类判别，可以在今后的研究中进行推广。在今后的研究中，可利用框架法对不同种类的鱼进行鉴别并结合耳石的傅立叶分析进行验证，从而使结果更加严谨、准确。