1例复合杂合突变导致遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的基因分析

方伟伟，郭跃丽，奚经巧

（温州市中医院，浙江 温州 325015）

凝血因子Ⅺ （FⅪ），又称为 “血浆凝血活酶前质”，主要在肝细胞和巨核细胞中产生合成。可通过凝血酶、活化的凝血因子Ⅻ或自身裂解所激活，生成活化的FⅪ（FⅪa），进而激活凝血因子Ⅸ，从而活化凝血级联反应。遗传性FⅪ缺陷症为常染色体隐性遗传，男女均可发病。患者临床出血表现轻重不一，主要表现为创伤或手术后出血增多，鲜有明显的自发性出血，且FⅪ活性（FⅪ：C）水平高低与出血程度并不相关[1]。目前认为该疾病的发生与FⅪ的基因突变有关[2]。本研究通过对一个复合杂合性（F11）基因突变导致的遗传性FⅪ缺陷症家系进行实验室表型检测与基因突变定位分析，初步探讨其分子致病机制。

1 病例介绍

先证者，男，28岁。2018年6月因腮腺良性肿瘤收住入院，术前凝血常规检查发现活化部分凝血活酶时间（APTT）为84.2秒，进一步检查发现FⅪ：C 为 3%，FⅪ抗原（FⅪ：Ag）为 8.6%。其他相关凝血指标均无明显异常，肝、肾功能正常，初步诊断为“FⅪ缺陷症”。征得先证者及其家系成员知情同意后调查先证者及其家系3代6人，均无自发性出血症状，先证者父母非近亲结婚，家系遗传图谱详见图1。正常对照：选择100例体检健康者，年龄22-56岁，无肝、肾功能异常，且无其他基础性疾病，其中男53例，女47例，用于排除基因多态性。

2 方法

2.1 样品采集与处理 采集受检者外周静脉血2.7mL，采用0.109mol/L枸橼酸钠1:9抗凝，3000r/min离心10分钟，留取上层乏血小板血浆用于凝血指标检测，下层血细胞用于提取基因组DNA。

图1 遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系图

2.2 实验室表型检测 APTT、血浆凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原（FIB）、FⅪ：C、FⅧ活性（FⅧ：C）、FⅨ活性（FⅨ：C）、FⅫ活性（FⅫ：C）等凝血指标采用一期凝固法在法国STAGO STA-R全自动血凝仪上检测（配套试剂由法国STAGO公司提供）；FⅪ：Ag采用酶联免疫吸附测定法检测。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

2.3 基因分析 DNA提取采用非离心柱型基因组DNA抽提试剂盒抽提先证者及家系成员的外周血基因组DNA。根据人类（F11）基因序列（GenBank AYl91837），应用primer 5.0软件共设计13对引物，以覆盖（F11）基因的15个外显子区域及其侧翼序列。引物序列及PCR反应条件参见文献[2]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性标本纯化后进行测序（上海桑尼生物科技有限公司）。将测序结果与Genbank 数据库中（F11）基因序列（NG_008051.1）比对，发现突变位点后反向测序予以证实。先扩增先证者（F11）基因各外显子、侧翼序列以及5′端、3′端非翻译区，发现突变位点后再扩增其他家系成员相应外显子片段。

2.4 氨基酸突变位点保守性分析 用ClustalX-2.1-win软件将突变氨基酸与其他同源物种：黑猩猩（Pan troglodytes）、猕猴（Macaca mulatta）、家犬（Canis lupus familiaris）、牛 （Bos Taurus）、小 家 鼠（Mus musculus）、 褐 鼠 （Rattus norvegicus）、 原 鸡（Gallus gallus）、热带爪蟾（Xenopus tropicalis）（同源物种氨基酸序列来源：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene）的氨基酸序列进行比对，分析突变氨基酸在物种进化过程中的保守性。

2.5 氨基酸突变前后生物信息学特性分析 用MutationTaster（http：//www.mutationtaster.org）（蛋白质参考ID：P00747和蛋白质参考转录本ID：ENST00000308192）在线生物信息学软件，通过评分结果预测基因突变对蛋白质功能的影响，分数越接近1表明预测结果越可靠。

2.6 氨基酸突变前后蛋白质局部空间构，型变化分析 根据已知的FⅪ蛋白质结构模型构建突变后模型，针对突变位点用Swiss-PdbViewer软件分析（F11）基因突变前后由氨基酸变化引起的蛋白质空间结构的改变。

3 结果

3.1 实验室表型检测 先证者的APTT为84.2秒，明显延长，其FⅪ：C和FⅪ：Ag均明显下降，分别为3%和8.6%；家系成员中其父亲、母亲、祖父和外祖母的FⅪ：C和FⅪ：Ag均下降至参考值的一半左右，其母亲和外祖母的APTT稍延长于参考值，其他相关凝血指标均无明显异常。详见表1。

表1 先证者及家系成员实验室表型检测结果

3.2 基因分析 先证者（F11）的基因第7号外显子存在c.738G＞A杂合无义突变导致p.Trp228stop，第12号外显子存在c.1325delT缺失突变导致p.L424CfsX8。其母亲和外祖母存在p.Trp228stop突变杂合子，其父亲和祖父存在p.L424CfsX8突变杂合子。详见图2、表2。

图2 （F11）基因第7和第12外显子测序结果。2A：c.738G＞A 杂合无义突变；2B：c.738G 野生型；2C：c.1325delT缺失突变；2D：c.1325野生型。

表2 先证者及家系成员基因分析结果

3.3 同源性分析 ClustalX-2.1-win软件保守性分析结果显示，Leu424在同源物种间呈高度保守。详见图3。

图3 Leu424同源性分析结果图

3.4 突变对蛋白影响力评估 Mutation Taster对p.Leu424Cys的评分结果为1.000分，预示此突变可引起相关疾病。

3.5 模型分析 Swiss-PdbViewer软件对FⅪ蛋白质进行模型分析发现，在野生型FⅪ蛋白质中非极性疏水性的Leu424与Pro421之间有一个氢键连接；当突变为极性亲水性的Cys424后，原有的氢键没有改变，但与Pro421的同一部位又多了一条氢键连接，导致蛋白空间结构发生改变。详见图4。

4 讨论

成熟的FⅪ分子是由两条多肽链通过二硫键连接形成的二聚体，FⅪ单链羧基端是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域（SP），氨基端由苹果状结构域（AP）组成。遗传性FⅪ缺陷症主要与（F11）基因突变有关，在其突变的数据（http：//www.factorⅪ.com/）显示：突变分布于（F11）基因的各结构域，SP区的突变相对集中。FⅪ缺陷症在一般人群中的发生频率为1/10万～1/100万[3]，而后续的研究数据显示：轻度FⅪ缺陷症的发生率比预期的要高[4]。FⅪ缺陷症的发病率与基因突变类型具有种族差异。该病在犹太人群中尤其高发，纯合突变患者比例可高达1/190。人类基因组数据库 （Human Gene Mutation Database，HGMD，http：/www.hgmd.cf.ac.uk/ac/a11．php）共收录（F11）基因突变 240余种，其中78.3%为错义突变和无义突变，9.8%为剪切位点突变，7.4%为小片段的缺失，剩余4.5%则为其它类型突变。遗传性FⅪ缺陷症分为2型，FⅪ：Ag和FⅪ：C同步下降，属于交叉反应物质（crossreation material，CRM）阴性型，若 FⅪ：C 降低而 FⅪ：Ag正常则为CRM阳性型。本文通过对一个遗传性FⅪ缺陷症家系进行实验室表型检测与基因突变分析，共发现了2个基因突变，分别为c.738G＞A无义突变和c.1325delT缺失突变，均为CRM阴性型。

2003年武文漫等[3]首次报道位于AP3的c.738G＞A 杂合无义突变（p.Trp228stop）。Shao等[5]发现该突变在57个中国FⅪ缺陷症家系最为常见，是中国人群FⅪ缺陷症的热点突变，且为中国人所特有。p.Trp228stop突变翻译而成的是截短型蛋白，高度不稳定并迅速被降解[6]。但也有研究认为，该无义突变产生的含有提前终止密码子的mRNA可被一种称之为 “无义介导衰变的mRNA监视系统”迅速降解，使得循环中FⅪ减少[7]。

图4 FⅪ蛋白质模型图。4A：野生型；4B：突变型；绿色虚线为氢键。

Leu424位于第12号外显子SP区域，c.1325delT即1325号位置的T碱基缺失导致424后所有的氨基酸发生移码突变。氨基酸保守性分析显示，Leu424残基在同源物种间呈高度保守，提示它是FⅪ分子的一个重要功能性位点。MutationTaster生物信息学预测软件显示此突变为有害突变，可对蛋白质功能造成一定的影响，从而引起相应疾病。通过构建氨基酸突变前后结构模型可见424位Leu被Cys所替代并且在431位出现终止密码子，导致编码蛋白翻译提前终止而产生截短蛋白。该蛋白因缺失部分结构域，高度不稳定，功能域的缺失及不稳定性的增强影响了催化活性区[6]，这可能是FⅪ：C及FⅪ：Ag下降的原因。

先证者基因分析显示，（F11）基因第7号外显子存在c.738G＞A杂合无义突变导致p.Trp228stop，及第12号外显子c.1325delT缺失突变导致p.L424CfsX8。其母亲存在p.Trp228stop突变杂合子，其父亲存在p.L424CfsX8突变杂合子，结合家系图，先证者的p.Trp228stop杂合突变遗传自其母亲，p.L424CfsX8杂合突变遗传自其父亲。其父母为单一的杂合突变，FⅪ抗原与活性水平均降低至正常范围的一半左右，双重杂合突变导致先证者FⅪ抗原与活性水平极度降低，因此，该复合杂合突变与先证者FⅪ水平降低有关。有报道指出遗传性FⅪ缺陷症的单一纯合突变和双重杂合突变都可导致血浆FⅪ：C下降至15%以下，单一杂合突变的下降程度为15%～70%[8]，与本文家系中有基因缺陷的家系成员FⅪ：C下降程度一致。本文100例正常对照者的基因均未发现p.L424CfsX8，排除了基因多态性的可能，同时查阅相关网站和文献，p.L424CfsX8突变尚未见报道。

综上所述，本文通过对一个遗传性FⅪ缺陷症家系进行实验室表型检测和基因突变分析，发现了p.Trp228stop杂合无义突变和p.L424CfsX8杂合缺失突变，后者为国内外首次报道。该家系人员FⅪ水平减低与这两种突变有关，但其确切的致病机制有待进一步研究。