甘蓝夜蛾信息素类似物的设计合成及初步活性研究

马好运, 王安佳, 翁爱珍, 王留洋, 梅向东, 折冬梅, 宁 君

(中国农业科学院 植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

甘蓝夜蛾(MamestrabrassicaeLinnaeus)隶属于鳞翅目夜蛾科，具有群集性、夜出性和暴食性等特点，在我国西北、华北和东北等地区均有出现[1]。目前农业仍依赖化学农药防治甘蓝夜蛾，目前防治效果较好的化学药剂有高效氯氟氰菊酯、溴除虫菊酯、溴虫腈和灭多威等[2]，但是对甘蓝夜蛾绿色防治的研究报道较少。化学农药的长期使用，不仅会对人类健康和环境安全产生威胁，而且会导致害虫的抗性问题越来越凸显，因此迫切需开发和寻找绿色、经济、高效的害虫防控新技术。

昆虫信息素是昆虫个体与同物种其他成员间进行通讯的化学信号[3]，绝大多数昆虫利用这种化学信号进行定位和特异性识别，从而完成交配和繁殖[4]。1978年Bestmann等[5]首次采用气相色谱与质谱联用技术(GC-MS)鉴定出甘蓝夜蛾信息素的主要成分为顺-11-十六乙酸酯。Hiria等[6]确认了顺-11-十六乙酸酯为甘蓝夜蛾的主要成分，并进行了田间实验。Veire等[7]将未交配的雌虫性腺的提取物进行GC-MS分析后，发现有效成分为顺-11-十六乙酸酯、顺-11-十七乙酸酯和十六烷基乙酸酯质量比为8/1/1，电生理实验发现雄虫对顺-11-十六乙酸酯的响应值较高。此后国外有关甘蓝夜蛾信息素组分的鉴定时有报道，而国内对甘蓝夜蛾信息素的研究较少。与化学农药相比，昆虫性信息素防治害虫具有灵敏度高、专一性强、微量高效、使用方便、环境友好、不误伤天敌及价格低廉等特点。进入21世纪以来，人们利用昆虫信息素干扰交配治理害虫的面积以几何级的速度增加[8-9]。但天然的信息素易于降解、持效期短，长期单一使用某些性信息素组分可能导致害虫产生抗性等问题[10-11]，因此寻求稳定高效、经济环保的昆虫性信息素替代物成为亟待解决的问题。

人工合成的(自然界中不存在)但结构与天然性信息素组分相似的性信息素类似物，同样能调节昆虫的行为，继而影响昆虫化学通讯[12]。Burger等[13]对苹果异形小卷蛾(Laspeyresiapomonella)的研究发现，将合成过程中的副产物7-乙烯基癸烷乙酸酯，添加到其性信息素组份(Z)-8-十二碳烯乙酸酯和(E)-8-十二碳烯乙酸酯中，可有效地干扰未交配雌虫或性信息素诱芯对雄虫的吸引。Carmen等[14]设计合成了一系列蛀茎夜蛾(Sesamianonagrioides)的卤代烷酯性信息素类似物，在EAG试验中均能显著降低雄虫对性信息素的响应值。将类似物与性信息素以质量比1/10混合时，能显著地干扰雄虫对雌虫性信息素的识别及定位。董梦雅等[15]以小菜蛾信息素(Z)-11-十六碳烯乙酸酯为母体结构，设计合成了多种性信息素类似物，并进行了室内活性测定，发现合成的信息素类似物能有效干扰雄虫对诱芯的定位，对昆虫的求偶过程产生迷向作用。陈展册等[16]对9种绿盲蝽性信息素类似物进行了活性验证。室内触角电生理反应试验表明，绿盲蝽对其中的反-2-丁酸己烯酯EAG响应值最高。Den等[16]通过单细胞记录显示，在顺-11-十六乙酸酯中添加顺-9-十四乙酸酯和顺-11-十六醇，能影响使雄虫产生逃避反应的B类型感觉细胞的活性。

本文以此为基础，根据甘蓝夜蛾信息素的主要成分顺-11-十六乙酸酯的结构与性质，对其进行了两种不同类型的结构修饰。(1)极性基团的修饰，即对甘蓝夜蛾性信息素上的酯键进行含氟或含溴基团的取代。(2)碳链双键的修饰，即将氟原子引入性信息素的碳链双键上，使其成为含氟的饱和化合物。合成的4种类似物(G1～G4， Scheme 1～Scheme 2)的结构经1H NMR, GC-MS和HR-MS(ESI)等表征。采触角电生理试验(EAG)初步测试了G1～G4的生物活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker DPX-300 MHz型核磁共振仪(TMS为内标)；Bruker solariX型质谱仪；Syntech型触角电位仪。

甘蓝夜蛾成虫采集于北京市延庆区旧县镇有机农业示范园;羽化未交配成虫来自于实验室饲养，[饲养条件为：(25±3)℃，相对湿度(70±10)%，光周期16 h/8 h(L/D)]，将羽化的成虫单独置于指型管中，并用10%的红糖水饲养备用;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)G1和G2的合成(以G1为例)

将反-11-十六碳烯-1-醇0.5 g溶于15 mL重蒸二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.01 g，三乙胺(TEA)0.32 g，于冰盐浴中不断搅拌，缓慢滴加3-氯丙酸酐0.32 g，滴毕，反应2 h(TLC跟踪)。用去离子水淬灭反应，分液，有机相依次用饱和食盐水(3×25 mL)洗涤，无水硫酸镁干，过滤，有机相经减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/50]纯化得目标产物反-11-十六碳烯-3-氯丙酸酯(G1)。用类似的方法合成反-11-十六碳烯-2-溴丙酸酯(G2)。

Scheme 1

Scheme 2

G1： 淡黄色油状液体，收率63%；1H NMRδ: 0.90(t,J=6.92 Hz, 3H), 1.30(m, 18H), 1.64(m, 2H), 2.01(m, 4H), 2.79(t,J=6.72 Hz, 2H), 3.76(t,J=6.72 Hz, 2H), 4.12(t,J=6.72 Hz, 2H), 5.36(m, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 14.0, 22.7～22.9(2C), 25.2～25.6(3C), 29.9～30.0(7C), 32.6, 52.5, 68.5, 129.8～130.3(2C), 158.4； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H35O2ClNa{[M+Na]+}339.206678, found 339.206871。

G2： 黄色油状液体，收率44%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.89(t,J=8.48 Hz, 3H), 1.30(m, 18H), 1.67(m, 2H), 1.82(d,J=6.72 Hz, 2H), 2.00(m, 4H), 4.16(t,J=9.11 Hz, 2H), 4.37(m, 1H), 5.35(m, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 13.9, 21.7～22.3(2C), 25.7, 29.1～29.7(7C), 31.8～32.6(3C), 40.2, 66.1, 68.5, 129.8～130.3(2C), 170.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H35O2BrNa{[M+Na]+}397.171809, found 397.171547。

(2)G3和G4的合成

将催化剂3,5-二(2-甲氧基-2-氧乙氧基)-4-碘苯甲酸甲酯0.02 g，间氯过氧苯甲酸(mCPBA)0.45 g和无水二氯甲烷50 mL加入聚乙烯平底烧瓶中，通入氮气作为保护气，加入顺-11-十六碳烯-1-醇0.5 g。用注射器吸取70%吡啶氢氟酸盐2.5 g，缓慢加入反应体系中，搅拌下反应12 h(TLC检测)。放入低温槽中，于-78 ℃分批加入碱性氧化铝15 g，加毕，反应0.5 h。缓慢升至室温，过滤，滤液依次用饱和Na2SO3溶液洗涤除去m-CPBA，用饱和食盐水(3×25 mL)洗涤除去水溶性杂质，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/6]纯化得11,12-二氟十六烷基-1-醇(G3)。用类似的方法合成11,12-二氟十六烷基乙酸酯(G4)。

G3： 淡黄色油状液体，收率30%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.92(t,J=11.88 Hz, 3H), 1.49(m, 24H), 3.59(m, 2H), 4.32(s, 1H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 14.0, 22.7～22.8(2C), 25.0～25.6(4C), 29.6～30.3(5C), 33.2, 62.8, 96.0(2C), 170.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H32OF2Na{[M+Na]+}301.231886, found 301.231458。

G4： 淡黄色油状液体，收率26%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.92(t,J=13.78 Hz, 3H), 1.52(m, 24H), 2.17(s, 3H), 4.05(t,J=13.50 Hz, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 13.9, 20.9, 22.5～22.6(2C), 25.0～25.8(4C), 29.6～31.2(6C), 64.6, 95.4, 97.6, 171.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C18H36O2F2Na{[M+Na]+}343.242457, found 343.242618。

1.3 室内生物活性测试

准确称取4种类似物分别溶于色谱纯正己烷中，配置成0.1 μg/μL、 1 μg/μL、 10 μg/μL、 100 μg/μL的待测溶液。并将不同浓度的信息素类似物组分均匀地涂抹在对折过的滤纸条上(长6 cm，宽1 cm)，待测溶剂挥发后将滤纸放入巴斯德管(长22.5 cm，内径6 mm)，以分析纯的正己烷作为对照，为保证测试结果的准确性，含有信息素类似物的滤纸条需现配现用。

将指型管中羽化2～3 d的甘蓝夜蛾成虫进行分类，从中挑选出健康的雄性甘蓝夜蛾进行EAG实验，实验前黑暗处理2 h，以模拟田间自然条件[17]。在显微镜下将雄虫的触角完整取出，然后用刀片将触角的尖端末尾切下。切好的触角通过装有0.1 M氯化钾溶液的玻璃电极连接在探头上，组成闭合回路。为保证实验的准确性，每头昆虫用一根触角，每个类似物的不同浓度做3个重复。对试验所得数据用SPSS 20.0分析软件，显著差异性分析利用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 合成

(1)对甘蓝夜蛾信息素极性基团的修饰，由于溴原子的空间位阻较大，且氯原子的供电子效应大于溴原子，因此含氯的类似物的收率高于含溴的类似物，且反应速度较快。(2)对甘蓝夜蛾信息素碳链双键的修饰，反应在丙酮和液氮控制的-78 ℃条件下，保证了反应体系中多余酸的缓慢中和，减少了副产物的发生。在进行柱层析过程中，由于类似物G3、G4的极性较小，在选择展开剂时，当展开剂为乙酸乙酯/石油醚=1/30或1/20时，目标化合物与杂质不能完全分离，当展开剂为乙酸乙酯/石油醚=1/10时，目标化合物与杂质基本分离，经过进一步的筛选，最终确定最佳的展开剂为乙酸乙酯/石油醚=1/6。此外，添加催化剂3,5-二(2-甲氧基-2-氧乙氧基)-4-碘苯甲酸甲酯能大幅度的提高反应速率。

杨新玲等[18]用AccuModel和PowerFit软件比较了蚜虫报警信息素EBF的氟取代类似物与EBF的结构相似性，并对非EBF系列物结构活性关系进行了研究。发现一氟取代化合物与EBF的结构相似，并推测一氟类似物可能有较好的活性。本文合成的含氟甘蓝夜蛾信息素类似物，氟原子与氢原子结构相似，能够准确的定位于昆虫性信息素受体位点，同时氟原子电负性较强，使得类似物分子具有极性和非极性的双重特性；使得类似物在通过昆虫磷脂双分子层时，能更有效地被昆虫嗅觉受体识别以及转化为电位信号进行传导[19]，因而推测含氟的甘蓝夜蛾性信息素类似物有较好的田间生物活性。

2.2 表征

以G4为例，分析了目标产物的1H NMR谱图。受羰基吸电子基团的影响，与羰基相连的末端CH3上氢的化学位移向低场移动，δ2.12附近表现为单峰。受氧原子电子云诱导效应的影响，与氧相连的亚甲基CH2的氢化学位移向低场移动，同时受临近碳原子上氢的耦合作用的影响，表现为三重峰，特征峰位于δ4.08附近。化合物末端CH3上的氢，受临近碳原子上氢原子的耦合作用影响，表现为三重峰，特征峰位于δ0.90附近。由于氟原子的电负性最大，与氟相连的两个碳原子上的氢受氟原子电负性的影响，化学位移向低场移动，特征峰位于δ3.62和δ4.38附近。其他24个氢原子的化学位移则在高场δ1.49附近。

δ图1化合物G4的1H NMR谱图

2.3 EAG活性

本文对4种类似物进行了雄虫触角电生理反应，结果见表1。由表1可见，甘蓝夜蛾对合成的4种结构新颖的类似物均有响应值，但响应值较小，在低浓度时与空白差异无显著性，但随着化合物浓度的增大，响应值也不断增加，所得实验结果对田间实验具有一定的指导作用。

表1 甘蓝信息素类似物直接刺激EAG活性*

本文设计合成4种结构新颖的甘蓝夜蛾信息素类似物，受空间位阻和电负性的影响，在合成G1、G2的反应中，含氯的类似物的反应速率大于含溴的类似物。在合成G3、G4的反应中，以丙酮和液氮为冷却介质，将反应温度控制在-78 ℃左右，减少了副产物地发生。为保证反应完全，加入过量的氢氟酸，反应完全后用碱性氧化铝除去多余的酸。室内活性测定表明甘蓝夜蛾对4种类似物均有一定的响应，且随着所用类似物浓度的增大，响应值也不断增加，但这些类似物是否具有较好的田间生物活性，有待于进一步研究。可见，昆虫信息素类似物对昆虫交配行为的干扰和抑制是一种合理的行为控制方法，能够有效解决天然信息素田间易降解、持效期短等问题，为甘蓝夜蛾的综合防治提供了新思路。