基于MAP-PRF复合的新型创口敷料合成及毒性研究

成 昭, 苗延青, 郑 蕾, 何 昊

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

皮肤是阻挡异物和病原体侵入、防止体液流失的重要人体防线。当皮肤完整性遭到破坏时，须及时进行皮肤创口保护与缺损修复，以防其裸露于外界、造成创面急慢性感染。传统创口处理和修复方式有皮肤敷料覆盖[1]、术后缝合等，但传统的方式侧重伤口覆盖与促愈、不易固定，使用时需注意防水、需进行创面换药等，或固定伤口的方式使得正常活动受限、无法保持创面的湿润、需拆线，存在诸多应用局限和再次感染风险。

Scheme 1

为了克服传统创口处理和修复方式的局限、实现伤口快速闭合、避免再次感染，同时进行皮肤功能模拟、促进伤口愈合，本文创新性地设计了复合遇水固化贻贝粘附蛋白MAP[2](mussel adhesive protein)粘合材料作为基材。在此基础上，将新西兰兔动脉血提取富含多种天然生长因子的富血小板纤维蛋白PRF[3](platelet-rich fibrin)进行MAP复合，合成了功能性的新型MAP-PRF复合创口敷料。相关研究工作在国内外均未见报道。

以MAP实现创口闭合、PRF实现创口促愈，针对皮肤创伤愈合经历的3个时期(炎症期、增生期和重塑期)，实现：1)创口初期处理时快速止血、闭合伤口防止二次感染[4]；2)中后期侧重促生和修复[5]、为新生组织提供营养，实现潮湿环境下的黏附性[6-7]，满足创口修复材料的防水要求与复杂环境适用性。同时，以仿生合成、生物提取等技术手段最大限度保证MAP-PRF材料的生物安全性及相容性、降低免疫排斥反应[8-9]。此外，MAP粘合材料能够满足特种环境免拆线、防水[10-11]、抗低温等需求，应用前景广阔。

以含有多羟基键连结构单元的聚合醇PPG1000、氰基键连结构单元的异氰酸酯IPDI为初始原料，在扩链剂DMPA、催化剂DBTL、碳二亚胺类缩合剂DCC作用下，通过聚氨酯预聚物合成、预聚物扩链两步合成得到可修饰调控的高分子基体，再接入邻二酚粘合单元[12-13]，完成贻贝粘附蛋白的仿生合成(Scheme 1)。粘合基材的仿生设计与MAP仿生合成能够初步保证其低毒性及生物相容性；同时，以分段调控方式合成聚氨酯材料，其高修饰性还可使该类新型粘合材料未来的功能化修饰成为可能。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UNICO UV-2012C/PC/PCS型紫外-可见分光光度计；BRUKER AVANCE Ⅲ 400 MHz型超导核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Agilent Technologie PL-GPC50型凝胶渗透色谱仪；Perkin Elmer PE-TGA7型热失重分析仪；Thermo Fisher 1510 Mwltiskan Go型多功能酶联免疫检测仪。

二丁基二月桂酸锡(DBTL)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；聚丙二醇1000(PPG 1000)、异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)、二羟甲基丙酸(DMPA)、N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和多巴胺盐酸盐等，分析纯，阿拉丁试剂有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1) 聚氨酯预聚物(1)合成

按摩尔比2/1.2混合IPDI与预处理后的PPG1000，搅拌均匀后，减压蒸馏，残余物真空干燥，加入干燥DMF，氮气氛围下反应6 h得透明油状的聚氨酯预聚物。间隔取样，用二正丁胺-盐酸法确定-NCO已消耗完全。

(2) 聚氨酯预聚物扩链产物(2)的合成

以物质的量比为1/2/0.2混合聚氨酯预聚物、扩链剂DMPA和催化剂DBTL，搅拌均匀，在氮气氛围下反应3 h，得到透明油状的扩链产物。

(3) MAP粘合材料(3)的合成

扩链反应结束后，将反应体系冷却至0 ℃，向扩链反应产物中加入缩合剂DCC、黏性结构单元多巴胺盐酸盐、三乙胺和DMF，使扩链产物、DCC、多巴胺盐酸盐、三乙胺和DMF 的物质的量比为1/0.12/1/0.1/15，搅拌均匀，置于室温下反应6 h，反应结束后，用浓度为2 mol/L的稀盐酸反复沉淀，对沉淀物进行多次透析、纯化后，所得的产物自然干燥，得到浅黄色至近无色的目标粘合基材MAP。

(4) PRF微粒及MAP-PRF复合敷料的合成

取新西兰兔动脉血，离心，分出淡黄色凝胶层，即为凝胶状PRF。将新鲜PRF 放入无菌培养皿，冷冻干燥24 h后，于无菌研钵中研磨，过200目无菌筛网收集冷冻干燥的PRF微粒，存于无菌EP管中，密封于-80 ℃保存。

质量浓度/(g·L-1)
图1催化剂DBTL加入前后，PPG1000-DMPA-多巴胺粘合材料的吸光度-质量浓度曲线

Figure 1Absorption-mass concentration curves of PPG1000-DMPA-dopamine with and without DBTL catalyst

图2PPG1000-DMPA-多巴胺粘合材料的1H NMR谱图

分别将PRF与MAP于水中均匀分散，恒温搅拌条件下将两者缓慢混合均匀，加入24孔板，每孔0.5 mL，于-20 ℃下存放24 h，再经25 ℃复融24 h得MAP-PRF复合修饰的创口敷料。

2 结果与讨论

2.1 表征

(1) UV-Vis吸光度-质量浓度线性关系与枝节率

分别配制5×10-5、 1×10-4、 5×10-4、 1×10-3g/L的多巴胺、PPG1000-DMPA-多巴胺与PPG1000-DMPA-DBTL-多巴胺的DMSO溶液，进行常温UV-Vis测定实验，建立吸光度-质量浓度的吸收曲线(图1)。对比多巴胺的标准吸收曲线，可判断粘合材料聚氨酯侧链中粘合单元多巴胺的引入量，进一步分析催化剂DBTL加入与否对聚氨酯预聚物在扩链反应中枝节率的影响，以及枝节率与多巴胺对MAP材料粘合性能的影响。未来研究工作中，还可通过调控催化剂DBTL的加入量，进一步调控材料粘合性能与枝节率等。

(2)1H NMR

图2为PPG1000-DMPA-多巴胺粘合材料的1H NMR谱图。由图2可见，δ8.12处特征峰与多巴胺酚羟基与酰胺键活性氢的特征峰位置一致，说明扩链反应发生，聚氨酯侧链成功接入邻二酚粘合功能单元多巴胺。

(3) GPC

在40 ℃下，聚苯乙烯作为标准聚合物、含0.01 mol/L溴化锂的DMF作为流动相，流速1.0 mL/min，用GPC测得聚合物分子量及其分布，结果见表1。由表1可知，多分散指数PD数值接近1，可见聚合材料分布均匀，黏均摩尔质量Mv为1039。

表1 PPG1000-DMPA-多巴胺分子量及分布

2.2 MAP粘合材料热稳定性

取样量约为5 mg，氮气氛围下，在20 ℃/min、 40～600 ℃条件下进行目标粘合材料热失重分析(图3)。由图3可见，PPG1000-DMPA-多巴胺热失重呈平滑曲线，与弹性体的热稳定趋势一致[14-16]，热稳定性良好。PPG1000-DMPA-多巴胺存在两个主要失重段，集中在250～350 ℃，是由聚氨酯具有的软段及硬段结构决定的：第一个片段是由于异氰酸酯IPDI和扩链剂DMPA分解产生，第二个片段是由于聚二醇PPG1000的分解产生[15]。

图3粘合材料PPG1000-DMPA-多巴胺的热重分析曲线

2.3 MAP-PRF复合创口敷料对ECV304细胞的增殖抑制作用

将处于对数生长期的EVC304细胞，接种于96孔板，37 ℃、 5%CO2及90%湿度培养24 h使细胞贴壁，更换新的培养基，加入目标粘合材料的DMF溶液，使其终质量浓度为100 μg/L，对照组加入等体积溶剂，每组设6个平行孔。加样完毕后，将96孔板置于恒温培养箱中培养24 h，除去培养基，每孔加入配置好的20 μL MTT溶液和180 μL培养液，培养4 h。移去上清液，每孔加入150 μLDMSO，以60次/min的频率震荡10 min后，用酶标仪测定490 nm处吸光度A值，计算RGR(%)(relative growth rate，细胞相对增值率，表2)。依据细胞毒性评价标准[17-18]：RGR≥100%，细胞毒性等级为0级；80%～99%为1级毒性；50%～79%为2级毒性；30%～49%为3级毒性；0～29%为4级毒性。结果表明，MAP-PRF创口敷料在ECV304细胞中的毒性较小，毒性等级评价为0级。

以粘合材料MAP为基体、复合生物提取的PRF，结合MAP的生物粘合与PRF促愈性能，经预聚物合成、预聚物扩链得到侧链含羧基聚氨酯、邻二酚粘合单元接入得到侧链含多巴胺聚氨酯、PRF复合等步骤，合成得到一种新型MAP-PRF复合创口敷料。该复合创口敷料细胞毒性低、热稳定性好，可进一步用于生物医药领域的软组织快速缝合及硬组织粘接。

此外，可在保证材料的生物安全性及生物相容性的基本前提下，还可针对MAP合成路径中得到的聚氨酯结构-性能可调控性、易于制备等优点，进行材料功能性再修饰，考查以PEG、 PPG等多种二元醇为初始原料制备得到MAP的粘合度、亲水性、生物相容等性能，再复合快速止血、促进愈合、防水等功能因子，实现快速闭合创口、免拆线或减少创口换药次数等特性，扩大MAP-PRF复合创口敷料的适用性，解决传统皮肤敷料的不足。