响应面法优化外源因子对酵母菌的油脂代谢研究

陈韵，陆丽珠，张瑾，梁舒妍，江志彬，王漫君，钟先锋

（佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山528225）

当今社会的快速发展，使得人类所面临的能源和环境压力日益增大，为解决这个问题，各国均在努力多渠道开发可再生生物质资源。生物柴油因其具有可再生、环境友好、与柴油成分相近等优点成为解决此问题的热点研究方向[1]。目前用于生物柴油生产的原料主要是动植物油脂、餐饮地沟油等[2-3]。但动植物油脂成本较高，且供给有限，限制了生物柴油规模化生产[4-7]。产油微生物中酵母菌油脂脂肪酸组成与植物油相似，且含量高，是代替动植物油脂成为制备生物柴油的重要原料[6，8-9]。与植物油和动物油生产相比，微生物细胞生长十分迅速、生长周期较短，同时微生物生长所需原料来源比较广泛，具有利用一些农业废弃物的水解物作为生长所需营养物质的能力，能够解决能源短缺问题的同时还有利于环境保护[10-12]。

微生物油脂的合成都是从乙酰辅酶A的合成开始，再经过多次碳链延长后，在去饱和酶的去饱和作用下，最终生成油脂[13]。在油脂合成的过程中，添加脂肪酸合成过程中所产生的中间产物，或能影响脂肪酶活性的物质，如乙酸盐、甘油等，以及某些维生素B类物质，可提高油脂的含量[13]。本研究以充分利用木质纤维且进一步生产微生物油脂为目的，采用响应面优化法研究添加外源因子对酵母菌产油脂代谢的影响，通过因素交互作用分析，建立响应面回归模型，对各因素进行优化，以确定各外源因子的最佳添加配方，以期加快利用木质纤维素水解液生产微生物油脂的工业进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）CICC 32489：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

玉米秸秆：佛山科学技术学院食品科学与工程学院。

1.1.2 培养基

固体培养基：5°Bé麦芽汁 1.0 L，琼脂 15.0 g，自然pH值。

种子培养基：KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，酵母粉2 g/L，葡萄糖4 g/L，自然pH值。

玉米秸秆水解液的培养基：KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，酵母粉 2 g/L。

以上培养基均要在121℃，0.1MPa下灭菌20min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养

斜面培养：将已活化的菌种接种到固体培养基中，在28℃，180 r/min的条件下培养2 d。

种子培养：将斜面培养基中菌种接种几环到装有100 mL液体培养基的锥形瓶中，在28℃，180 r/min条件下培养48 h后，得到种子液。

产脂发酵：将上述得到的种子液接种到玉米秸秆水解液培养基中，摇床培养1 d～12 d。

1.2.2 玉米秸秆粗水解液的制备

称取80 g玉米秸秆粉末，置于1 000 mL三角瓶中，加入800 mL浓度0.5%的稀硫酸，振荡摇匀，121℃预处理90 min，冷却后调节pH值至5.5，再加入2.5%纤维素酶和木聚糖酶混合物（1∶1，质量比），50℃水解48 h后，离心取上清液，得玉米秸秆粗水解液。

1.2.3 玉米秸秆水解液脱毒处理

向粗水解液中加入Ca（OH）2粉末，调节pH值至10，静置1.5 h，过滤，除去水解液中的沉淀。滤液用5 mol/L的H2SO4调节pH值到5.5，静置1 h后过滤取上清液，然后沸水浴20 min，待其冷却后过滤备用。

向经脱毒处理的玉米秸秆水解液中添加KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母粉2 g/L，制备利于微生物发酵产油脂的玉米秸秆水解液培养基。

1.2.4 生物量的测定

发酵液在4 000 r/min离心10 min，收集菌体在105℃烘干至恒重。

1.2.5 油脂含量、油脂产量测定

将发酵液离心收集菌体，每克湿菌体加入10 mL浓度4 mol/L的盐酸，振荡摇勾，室温（25℃）放置半小时后，沸水浴10 min，-20℃冷冻30 min。加入乙醚和石油醚的混合液20 mL（体积比为1∶1）振荡摇匀，4 000 r/min离心10 min，萃取有机层。再加入乙醚和石油醚的混合液，重复上述步骤，合并有机层，混合后离心，挥发机层。于105℃，烘至恒重，冷却后计算油脂含量和油脂产量。

1.2.6 总糖测定

试验参考文献[14]的方法，采用3，5-二硝基水杨酸法测定培养基中还原糖浓度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程y=0.486x+0.001 1，相关系数R2=0.999 5。

1.2.7 单因素试验设计

分别添加不同浓度的甘油（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、乙酸钠（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、柠檬酸钠（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、维生素B6（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）至玉米秸秆水解液培养基中，考察了4种外源因子对酵母菌发酵培养基产油脂的影响。

1.2.8 响应面试验设计

根据单因素试验结果，以乙酸钠（A）、维生素B6（B）、甘油（C）、柠檬酸钠（D）为自变量，以生物量（Y1）、油脂含量（Y2）、油脂产量（Y3）为响应值，使用 Design-Expert 8.0.6软件设计响应面试验，因子编码及水平见表1。

表1 响应面试验设计因素和水平Table 1 Factor and levels in response surface analysis

1.3 数据分析

试验数据用Office Excel 2010统计分析，Design-Expert 8.0.6软件，Origin 9.0软件等进行统计分析、作图。单因素试验中用单因素试验统计进行方差分析处理，处理后采用Duncan新复极差法进行比较，并使用字母标记法进行标记。

2 结果与分析

2.1 酵母菌发酵玉米秸秆水解液培养基产油脂

采用酸水解结合酶解的方法制备玉米秸秆水解液培养基，3，5-二硝基水杨酸法测到培养基的总糖为24.332 g/L。将种子液接种到玉米秸秆水解液培养基中，28℃，180 r/min条件下摇床培养7 d，测到生物量为18.79 g/L、油脂含量30.31%、油脂产量5.70 g/L。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 甘油对酵母产油脂的影响

甘油在磷酸化作用下转变为油脂合成所需要的3-磷酸甘油，从而为油脂提供合成的前体[15]。甘油对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响见图1。

图1 甘油对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响Fig.1 Effects of glycerin on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

由图1可知，当添加0.1%～0.5%甘油时，生物量、油脂含量、油脂产量都呈现先增大后减小的变化趋势，在甘油添加量为0.3%时有最大值，分别为生物量20.12 g/L、油脂含量30.68%、油脂产量6.17 g/L。随着甘油浓度增大，以上指标均下降，原因可能是加入过量甘油后培养基在摇瓶培养的过程中容易起泡，泡沫过多会影响到培养基中氧气的溶解度，最终会影响菌体油脂的积累[16]。综合上述指标评价，选择添加甘油0.20%～0.40%进行Box-Behnken响应面法优化试验。

2.2.2 乙酸钠对酵母产油脂的影响

乙酸钠可促进无活性的单体聚合成有活性的全酶，从而加速脂肪酸的合成。乙酸钠中含有的乙酰基能和辅酶A结合，转化生成的乙酰辅酶A是脂肪酸合成和能量代谢的重要前体，因而可以为脂肪酸合成提供更多的底物供应[17-18]。乙酸钠对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响见图2。

图2 乙酸钠对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响Fig.2 Effects of sodium on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

由图2可知，乙酸钠添加量0.1%～0.3%，生物量、油脂含量、油脂产量均增加，在0.3%时有最大值，分别为17.28 g/L、30.26%、5.23 g/L。当添加量超过0.3%时，生物量、油脂含量、油脂产量都显著减小。原因可能是乙酸钠添加过量会改变培养基的pH值，从而影菌体的正常的生长[17]。综合上述指标评价，选择添加乙酸钠0.20%～0.40%进行Box-Behnken响应面法优化试验。

2.2.3 柠檬酸钠对酵母产油脂的影响

乙酰辅酶A是微生物在体内积累油脂的必备因子，它主要存在于线粒体中，而脂肪酸的合成是在细胞质内，乙酰辅酶A以柠檬酸的形式通过三羧酸循环系统从线粒体运送到细胞质中，其中柠檬酸作为重要的中间产物，对油脂的合成起着重要的作用[19]。Brown等[20]研究表明柠檬酸是脂肪酸合成的主要前体物质，是油脂合成启动的源头。研究柠檬酸钠添加量对酵母菌产油脂的影响结果见图3。

图3 柠檬酸钠对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响Fig.3 Effects of sodium citrate on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

如图3所示，加入一定量的柠檬酸钠，菌体的生物量、油脂含量、油脂产量等升高，但加入过量时以上指标均下降，原因可能是柠檬酸钠作为一种盐类，加入过量时对菌体表面细胞膜产生负面影响，从而影响菌体对培养基中离子的吸收利用。综合上述指标评价，选择添加柠檬酸钠0.40%～0.80%进行Box-Behnken响应面法优化试验。

2.2.4 维生素B6对酵母产油脂的影响

丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，Pyc）是胞质还原三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA循环）途径中的关键酶，它通过CO2固定催化丙酮酸转化为草酰乙酸，而如果体系中没有足够的草酰乙酸参与到柠檬酸的合成，柠檬酸的缺乏会成为油脂合成的限速步骤[21]。因此，Pyc在脂肪酸的生物合成中发挥重要作用，维生素B6提高Pyc的活性，减少丙酮酸的积累，最终促进油脂的合成[22-23]。同时，维生素B6是脱氢酶的辅酶，它能提高脱饱和酶的活性，促进脂肪酸脱氢生成双键，最终能够提高脂肪酸的不饱和度[24]。维生素B6对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响见图4。

如图4所示，当维生素B6添加量0.01%到0.05%，菌体生物量在14.96 g/L到16.16 g/L变化，在添加量为0.04%时有最大值16.16 g/L，变化幅度不大，说明添加维生素B6对圆红冬孢酵母菌体的生长影响不明显。在添加量为0.02%时，油脂含量、油脂产量最大，分别为31.26%、4.6 g/L，说明添加适量维生素B6是有助于菌体发酵产油脂。综合上述指标评价，选择添加维生素B60.01%～0.03%进行Box-Behnken响应面法优化试验。

图4 维生素B6对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响Fig.4 Effects of vtamin B6on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

2.3 响应面优化外源因子对微生物产油脂的影响

在单因素试验结的基础上，使用Design-Expert 8.0.6软件建立数学模型，以生物量、油脂含量、油脂产量为响应值，共设计了29个处理组，试验结果见表2。

表2 Box-Behnken设计方案及响应值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

续表2 Box-Behnken设计方案及响应值Continue table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

2.3.1 响应面回归模型的建立和分析

利用Design-Expert软件对表2试验数据进行多元回归拟合和方差分析，得到各因子对响应值的二次多项回归模型为：

回归方程模型方差分析（生物量）见表3，回归方程模型方差分析（油脂含量）见表4，回归方程模型方差分析（油脂产量）见表5。

表3 回归方程模型方差分析（生物量）Table 3 ANOVA for response surface quadratic model（biomass）

表4 回归方程模型方差分析（油脂含量）Table 4 ANOVA for response surface quadratic model（lipid content）

续表4 回归方程模型方差分析（油脂含量）Continue table 4 ANOVA for response surface quadratic model（lipid content）

表5 回归方程模型方差分析（油脂产量）Table 5 ANOVA for response surface quadratic model（lipid yied）

方差分析结果显示，模型的p值均＜0.01，差异极显著，而失拟项p值分别为0.785 3、0.175 3、0.624 3（p＞0.05），差异不显著，说明未知因素对试验结果的干扰较小，该试验模型充分拟合试验数据，即可以利用此回归模型反映各因素对菌体生物量、油脂含量、油脂产量的影响。

在表3回归方程模型方差分析（生物量）中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2影响均为极显著（p＜0.01），交互项AB 影响显著（p＜0.05），CD 影响极显著（p＜0.01）。根据F值对各因素的影响大小顺序为：D＞C＞A＞B，说明柠檬酸钠对圆红冬孢酵母生物量大小影响最大。

在表4回归方程模型方差分析（油脂含量）中，交互项 AB、AC、AD、BC、BD、CD 的交互作用对响应值没有显著影响，而一次项和二次项对圆红冬孢酵母发酵玉米秸秆水解液培养基的油脂含量的影响均为极显著（p＜0.01），根据F值大小，一次项对响应值影响大小顺序为：D＞B＞A＞C。

在表5回归方程模型方差分析（油脂产量）中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2对响应值影响均为极显著 （p＜0.01），A、B、C、D 各因素对酵母菌油脂产量的显著性大小依次为：D＞B＞C＞A。交互项AD、CD对响应值影响极显著（p＜0.01），BD 影响显著（p＜0.05）。

乙酸钠、维生素B6、甘油、柠檬酸钠对菌体发酵玉米秸秆水解液产油脂影响显著。

2.3.2 响应面交互作用分析与优化

响应面坡度越陡峭，等高线越密集并形成椭圆，说明两因素对响应值的交互作用越显著，反之则越不显著[25]。图5为各因素对菌体生物量的响应面分析图。

图5 各因素对生物量的响应面立体分析图Fig.5 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to biomass

由图5可见，结合表3方差分析结果，柠檬酸钠和甘油的交互作用极显著（p＜0.01），控制柠檬酸钠浓度不变，随着甘油浓度增大，生物量呈先上升后下降的趋势，柠檬酸钠也是如此；维生素B6和乙酸钠的交互作用显著（p＜0.05），生物量随着两者增大，表现出先增大后减小的趋势，与方差分析结果一致。图6为各因素对菌体油脂含量的响应面分析图。

图6 各因素对油脂含量的响应面立体分析图Fig.6 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid content

由图6可见，6组响应面立体分析图的坡度都较陡，说明乙酸钠、维生素B6、柠檬酸钠、甘油等浓度增大都会使酵母的油脂含量产生显著性的先增大后减小的变化趋势。结合表4的方差分析结果，各因素间的交互作用对菌体油脂含量影响均不显著（p＞0.05），但各因素对酵母发酵玉米秸秆水解液培养基产油脂影响显著。图7为各因素对菌体油脂产量的响应面分析图。

由图7可见，响应面立体分析图的坡度较陡，说明各因素对酵母发酵玉米秸秆水解液培养基产油脂影响显著。各响应值随着各因素在一定范围内变化，均表现出是先增大再减少的变化趋势，说明在研究的因素水平范围内有最大值，结合表5回归模型方差分析结果，柠檬酸钠和乙酸钠、甘油的交互作用影响极显著（p＜0.01），维生素B6和柠檬酸钠的交互作用影响显著（p＜0.05）。

图7 各因素对油脂产量的响应面立体分析图Fig.7 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid yield

2.3.3 最佳添加量验证试验结果

通过Design-Expert8.0.6软件分析得到各外源因子添加量的最佳配方为乙酸钠0.33%、维生素B60.02%、甘油0.27%、柠檬酸0.66%，在此条件下，模型预测的生物量为28.82 g/L、油脂含量为43.18%、油脂产量为11.55 g/L。为了方便实际试验操作，将试验条件调整为乙酸钠0.35%、维生素B60.02%、甘油0.3%、柠檬酸0.65%，得到的生物量为（29.32±0.35）g/L、油脂含量为（43.75±0.26）%、油脂产量为（12.11±0.18）g/L，相比优化前分别提高了56.04%、41.95%、109.15%，试验结果偏差较小，数据稳定，证明该模型合理可靠。

3 结论

为进一步提高圆红冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）CICC 32489菌株的油脂产量，本课题研究了外源因子对菌体生物量和产油脂情况的影响，先通过单因素试验，确定外源因子的最佳添加量，在此基础上，通过Box-Behnken试验设计对乙酸钠、甘油、维生素B6、柠檬酸钠等4个因子进行响应面优化，得到的工艺参数为乙酸钠0.33%、维生素B60.02%、甘油0.27%、柠檬酸钠0.66%，生物量、油脂含量、油脂产量等相比优化前分别提高了56.04%、41.95%、109.15%，说明4种外源因子对酵母菌发酵玉米秸秆水解液培养基产油脂影响显著。