热处理对卵白蛋白理化性质及其ACE抑制活性的影响

张晓，杨锋，赵笑蕾

（广西科技大学，广西柳州545006）

鸡蛋清中含有丰富的蛋白质，其中包括卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、卵转铁蛋白、卵类黏蛋白、卵黏蛋白、溶菌酶和卵球蛋白等蛋白质组分，而最主要的卵白蛋白约占总蛋白的50%以上。卵白蛋白是一种由385个氨基酸组成，等电点为4.5，变性温度为84℃，分子质量约为45 kDa的单一肽链折叠形成的磷糖球蛋白[1]。血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是一种分子量为170 kDa的糖蛋白，是调节人体血压的一种关键酶[2]。ACE在调节血压中具有双重作用，它能将无催化活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有活性的血管紧张素Ⅱ，同时还能使舒缓激肽（降压物质）失活，从而导致血压升高[3]。程缘等[4]通过脱盐、超滤处理卵白蛋白源ACE抑制肽并对其ACE抑制活性及理化性质进行了研究，在超滤时间为40 min、操作压力为1.5 bar、温度为30℃的条件下测得的ACE抑制活性最高。Gül Akllllogˇlu等[5]通过不同时间的热处理来探究3种豆科类植物蛋白中ACE抑制活性的变化，结果表明，在121.1℃条件下处理50 min时，3种豆类蛋白中ACE抑制活性均有明显的提高。Elizabeth等[6]对火腿中多肽的ACE抑制活性进行了热处理研究，在117℃下处理6 min时得到的ACE抑制活性较高。

因此本文在不同温度下对卵白蛋白进行热处理，研究热处理对卵白蛋白理化性质的影响，并采用碱性蛋白酶来酶解热处理后的卵白蛋白，探究其水解度及ACE抑制活性的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋：市售；聚乙二醇 4000（polyethylene glycol，PEG）：天津市大茂化学试剂厂；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、1-苯胺-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、5，5'二硫代双（2-硝基 苯 甲 酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、对苯二甲酸、过硫酸铵、丙烯酰胺、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R250、茚三酮：阿拉丁试剂有限公司；碱性蛋白酶（20万U/g）：庞博生物工程有限公司；血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、马尿酰组胺酰亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）：美国Sigma公司；其它试验所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Nano ZS90纳米粒度、Zeta电位分析仪：英国Malvern公司；Bio-rad电泳系统：美国Bio-rad公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器公司；HSS-1型恒温水槽：成都仪器厂；F-320荧光分光光度计：天津港东科技股份有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取卵白蛋白

取新鲜的鸡蛋分离出蛋清，并用纱布过滤其中的絮状物得到干净的蛋清液。参考闻崇炜等[7]方法，在室温（25℃）条件下取一定量蛋清液用去离子水稀释2倍，并调其pH值至7.5，于9 500 r/min离心20 min，取上清液Ⅰ，搅拌并加入质量分数为50%的聚乙二醇4000（polyethylene glycol，PEG）直至其质量分数为总溶液的12%，于9 500 r/min离心20 min，取上清液Ⅱ，并调其pH值至5.5，于9 500 r/min离心20 min，再加入质量分数为50%的PEG 4000直至其质量分数为总溶液的24%，于9 500 r/min离心20 min，得到的沉淀即为卵白蛋白，冻干备用。

1.3.2 热处理卵白蛋白

将OVA样品配置为3%的分散液，采用水浴加热装置分别在室温（25℃）、60、70、80、90℃条件下对OVA样品溶液处理10 min，将装有处理后OVA样品溶液的烧杯立即放置于冰水中冷却至室温（25℃）。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

配置浓度为13%的分离胶和浓度为4%的浓缩胶。将OVA样品稀释至浓度为3 mg/mL，取30 μL稀释后的OVA样品溶液加入60 μL的样品缓冲液，混合均匀后在95℃条件下加热5 min，冷却后上样。电泳时OVA样品在浓缩胶中电流为16 mA，进入分离胶后将电流调为28 mA，电泳结束后，取出凝胶并倒入固定液在加热煮沸条件下固定5 min～6 min，然后倒入染色液在加热煮沸条件下染色5 min～6 min，在加热煮沸条件下进行脱色直至出现清晰的蛋白条带为止，最后使用凝胶成像系统进行成像处理。

1.3.4 粒径和Zeta电位的测定

通过Nano ZS90纳米粒度及Zeta电位分析仪来测定OVA样品的平均粒径和Zeta电位。将处理好的OVA样品溶液，选择Size测量软件在25℃的条件下测量，并取3次测量的平均值。再选择Zeta电位测量软件测量，取一个间距为0.4 cm并带有一对0.45 cm2铂电极的1 cm的聚苯乙烯样品池，在25℃的条件下平衡2 min，测量3次并取平均值。

1.3.5 巯基含量的测定

参考雷莉等[8]的试验方法，将OVA样品稀释至浓度为4 mg/mL，并取2 mL稀释好的OVA样品溶液加入5 mL的测试液（pH 8.0的Tris-Gly缓冲液用于测定暴露巯基含量；Tris-Gly-8Murea溶液用于测定总巯基含量），加入100μL4mg/mL的5，5'二硫代双（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid，DTNB） 溶液，在25℃恒温振荡器条件下振荡1 h后，于9 000 r/min离心10 min，取2 mL的去离子水中加入5 mL测试液及100 μL DTNB作为空白对照，并在412 nm处测定其吸光度值，按如下公式测定巯基含量：

式中：A412为除去试剂对照后加入DTNB样品的吸光度值；A1为除去试剂对照后不加入DTNB样品的吸光度值；C为蛋白浓度；D为稀释倍数；73.53为106/（1.36×104）。

1.3.6 内源荧光光谱的测定

参考Jiang等[9]的试验方法，采用荧光分光光度计对OVA样品溶液进行测定，设置其激发波长为290nm，扫描发射波长范围为300 nm～400 nm，激发和发射狭缝宽均为5 nm，电压为600 V。

1.3.7 表面疏水性的测定

参考Yin等[10]的试验方法，以1-苯胺-8-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 为荧光探针，用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 8.0）将OVA样品溶液稀释至不同浓度（0.48 mg/mL～2.4 mg/mL），分别取不同浓度的OVA样品溶液4 mL加入10 μL浓度为8 mmol/L的ANS，混合均匀后，在荧光分光光度计下测定，设定其激发波长为380 nm，发射波长480 nm，狭缝宽为5 nm，电压为600 V。以荧光强度对蛋白浓度作图并进行线性回归，并以线性回归斜率作为蛋白质的表面疏水性。

1.3.8 酶解卵白蛋白

参考黄群等[11]的试验方法，取一定量的1.2%OVA样品溶液，添加酶量为0.2%（以水解溶液重量计算），调其pH 8.5，在45℃条件下酶解3 h，酶解后加热到80℃灭酶10 min，即得到酶解溶液。

1.3.9 水解度的测定

采用茚三酮显色法[12]来测定其水解度。取酶解蛋白液0.1 mL定容至10 mL，取0.2 mL稀释液于试管中加入0.8 mL蒸馏水、1.0 mL显色剂，混匀后放入沸水浴中加热15 min，同时作空白试验。待溶液冷却后加入5.0 mL 40%的乙醇溶液混匀，静置15 min后在570 nm波长下测其吸光度。根据标准曲线计算出酶解前后中游离氨基的含量，并采用微量凯氏定氮法测定卵白蛋白中氨基酸的总量。水解度按下式计算：

1.3.10 ACE抑制活性的测定

参考Cushman等[13]的试验方法来测定ACE抑制活性，吸取25 μL酶解后的OVA样品溶液作为抑制剂，加到100 μL 5 mmol/L的马尿酰组胺酰亮氨酸（HHL）中，于 37℃水浴中加热 5 min；立即加入 25 μL ACE启动反应，再于37℃水浴中加热30 min，反应结束后，加入100 μL 1 mol/L的HCl终止反应；再向试管中加入1.9 mL的乙酸乙酯，于4 000 r/min离心10 min，吸取1 mL的酯层于100℃烘箱内蒸干，取出冷却后将其重新溶解于3 mL的去离子水中，在波长228 nm处测定吸光度值。具体计算公式如下：

式中：Aa为反应中ACE抑制剂及ACE同时存在的吸光度值；Ab为反应中不加入ACE抑制剂的吸光度值；Ac为ACE和HHL空白反应的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 卵白蛋白纯度分析

卵白蛋白电泳图谱见图1。

通过对SDS-PAGE电泳图进行光密度分析，卵白蛋白的纯度达到95%以上。

2.2 热处理对卵白蛋白粒径的影响

热处理对卵白蛋白粒径分布的影响见图2；热处理对卵白蛋白平均粒径的影响见图3。

图1 卵白蛋白电泳图谱Fig.1 Electrophoresis of ovalbumin

图2 热处理对卵白蛋白粒径分布的影响Fig.2 Effect of heat treatment on particle size distribution of ovalbumin

图3 热处理对卵白蛋白平均粒径的影响Fig.3 Effect of heat treatment on average particle size of ovalbumin

由图2可知，室温（25℃）下的卵白蛋白粒径呈两个峰分布，其中一个峰分布在0～10 nm处，另一个峰分布在100 nm～1 000 nm处，这与李弓中等[14]所研究的蛋清蛋白粒径分布基本相似。与处理前相比，当处理温度为60℃时，0～10 nm处的峰强度减弱，100 nm～1000 nm的峰强度增强；处理温度为70℃时，0～10 nm和100 nm～1 000 nm处的峰强度均减弱，且100 nm～1 000 nm处的峰向右偏移；处理温度为80℃和90℃时，0～10 nm处的峰强度均增强，100 nm～1 000 nm处的峰强度均减弱，且100 nm～1 000 nm处的峰都向左偏移。由图3可以看出，与处理前相比，热处理60℃和70℃时的平均粒径显著增大（P＜0.05），由（622.73±4.60）nm增大到（1 527.00±59.40）nm，当热处理温度为80℃和90℃时的平均粒径显著减小（P＜0.05），减小至（261.64±2.26）nm。平均粒径增大的原因是因为随着温度的升高，卵白蛋白开始发生聚集，从而增大了粒径。80℃和90℃时平均粒径减小的原因可能是因为温度接近或超过卵白蛋白的变性温度，蛋白质分子吸收热能运动加剧，分子间的接触与交联机会增加，通过疏水作用结合成为了可溶聚集体[15-16]，在较高温度下聚集体发生解离，从而导致平均粒径减小。

2.3 热处理对卵白蛋白Zeta电位的影响

热处理对卵白蛋白Zeta电位的影响见图4。

图4 热处理对卵白蛋白Zeta电位的影响Fig.4 Effect of heat treatment on Zeta potential of ovalbumin

Zeta电位是判断一个体系是否稳定的重要因素，电位的绝对值越大，代表体系越稳定，电位为负数时，说明蛋白质表面带负电荷的氨基酸比较多，若为正数，则相反[17]。由图4可以看出，与处理前相比，当处理温度为60℃时，Zeta电位变化不明显，当处理温度为70、80和90℃时，Zeta电位绝对值显著增大（P＜0.05），由（6.56± 0.36）mV 增大到（19.20± 0.62）mV。这可能是因为随着温度的升高，卵白蛋白发生变性，导致疏水基团暴露出来，在静电作用和疏水作用下形成了聚集体，带电的氨基酸排布在聚集体表面，使Zeta电位的绝对值增大。Yanqiu Ma等[18]在75℃干热处理卵白蛋白，Zeta电位由开始的-17.03 mV降至-19.77 mV，Zeta电位的绝对值增大，与本文结果相似。

2.4 热处理对卵白蛋白巯基含量的影响

热处理对卵白蛋白表面巯基含量的影响见图5；热处理对卵白蛋白总巯基含量的影响见图6。

图5 热处理对卵白蛋白表面巯基含量的影响Fig.5 Effect of heat treatment on surface sulfhydryl（SH）group content of ovalbumin

图6 热处理对卵白蛋白总巯基含量的影响Fig.6 Effect of heat treatment on total sulfhydryl（SH）group content of ovalbumin

由图5可以看出，随着温度的升高，卵白蛋白的表面巯基含量不断增加，当热处理温度为60℃时，表面巯基含量增加不显著（P＞0.05），处理温度为 70、80、90℃时，表面巯基含量增加的效果显著（P＜0.05），由（2.20±0.37）μmol/g增加到（23.76±0.71）μmol/g，这是因为热处理能使卵白蛋白分子展开，使内部的巯基暴露出来，导致表面巯基含量增加。图6则是热处理对卵白蛋白总巯基含量的影响，由图6可以看出，当处理温度为60、70、80℃时，总巯基含量减少，由（9.63±0.26）μmol/g减少到（6.46±0.16）μmol/g。当处理温度达到90℃时，总巯基含量显著增多（P＜0.05），增至（29.55±1.88）μmol/g。总巯基含量降低的原因可能是因为试验是在有氧条件下进行的，使部分巯基二硫键之间发生相互转换，从而导致总巯基含量减少。而90℃时总巯基含量增加的原因可能是由于温度超过卵白蛋白的变性温度，导致蛋白质构象改变，部分二硫键断裂生成巯基。Matsudomi等[19]在80℃干热条件下处理卵白蛋白，表面巯基含量增加，总巯基含量减少，与本文80℃前处理卵白蛋白的结果一致。

2.5 热处理对卵白蛋白内源荧光光谱的影响

热处理对卵白蛋白内源荧光光谱的影响见图7。

图7 热处理对卵白蛋白内源荧光光谱的影响Fig.7 Effect of heat treatment on intrinsic emission fluorescence spectra of ovalbumin

荧光光谱具有高灵敏性，是一种被广泛应用于研究蛋白质三级结构变化的重要手段[20]。由于蛋白质的荧光光谱是由色氨酸的化学环境决定的，因此色氨酸光学性质的变化常被用于考察蛋白质构象的变化[21]。当色氨酸向亲水环境迁移时，内源荧光光谱最大吸收峰会向长波长方向转移（红移）；当色氨酸向疏水环境迁移时，内源荧光光谱最大吸收峰会向短波长方向移动（蓝移）；若最大吸收峰没有发生偏移，只有荧光峰信号的减弱或者增强，则不能作为判断蛋白质构象发生明显改变的依据[22]。如图7所示，与处理前相比，随着温度的增加荧光强度也不断增强，但卵白蛋白的最大吸收峰只有在80℃和90℃时从340 nm迁移到339 nm。这可能是因为在较高温度的处理下使蛋白质聚集，色氨酸的微环境变得更加疏水。Nicoleta等[23]在pH 4.5的条件下对卵白蛋白进行热处理，随着温度的增加荧光强度也随之增强，在加热到90℃时，蛋白样品的最大吸收峰发生2 nm蓝移；Yanqiu Ma等[18]经干热处理后的卵白蛋白，荧光强度随着加热时间的延长而增大，蛋白样品的最大吸收峰发生了明显的蓝移，均与本试验研究结果一致。

2.6 热处理对卵白蛋白表面疏水性的影响

热处理对卵白蛋白表面疏水（H0）的影响见图8。

图8 热处理对卵白蛋白表面疏水（H0）的影响Fig.8 Effect of heat treatment on surface hydrophobicity（H0）of ovalbumin

由图8所示，与处理前相比，当热处理温度为60℃和70℃时，卵白蛋白的表面疏水性值增大，由（249.52±0.49）增大至（274.32±1.19）。这是因为热处理诱导蛋白分子展开，使埋藏在蛋白分子内部的疏水基团暴露，与ANS荧光探针的结合位点增多，进而导致蛋白质的H0增加。而当热处理温度为80℃和90℃时，卵白蛋白的表面疏水性值显著降低（P＜0.05），由（274.32±1.19）降至（135.17±14.81）。这是因为温度接近或超过卵白蛋白的变性温度，已经展开的蛋白分子通过疏水作用又重新结合起来，使暴露出来的疏水基团被重新埋藏于分子内部[15]，进而导致表面疏水性值降低。陶汝青等[24]研究了热处理对大豆分离蛋白结构的影响，结果表明，随着加热时间的延长，其表面疏水性先增加后降低，与本文结果相符。

2.7 热处理对卵白蛋白水解度和ACE抑制活性的影响

热处理对卵白蛋白水解度和ACE抑制活性的的影响见图9。

图9 热处理对卵白蛋白水解度和ACE抑制活性的的影响Fig.9 Effect of heat treatment on degree of hydrolysis and ACE inhibition activity of ovalbumin

由图9所示，与处理前相比，当温度为60℃时，水解度由（22.42±0.83）%增加到（28.62±0.42）%，而随着温度的增加，卵白蛋白的水解度出现下降趋势。水解度增加的原因是因为加热后的卵白蛋白分子结构疏松，使蛋白水解酶的作用点增加，卵白蛋白更容易被酶解，所以水解度出现上升趋势。而水解度下降的原因是由于温度过高，蛋白质分子发生不同程度的聚集，内部基团被重新包裹，松散的多肽链又会重新结合起来，这样反而阻碍了酶对蛋白的水解[25]，导致水解度下降。随着热处理温度的升高，ACE抑制活性有不同程度的增大，80℃时的抑制活性能达到（79.17±0.54）%。由图9可知，卵白蛋白的水解度与其ACE抑制活性并没有表现出严格的线性关系，即水解度高并不意味着ACE抑制活性也一定高，这与范远景等[26]用5种不同的蛋白酶酶解大豆分离蛋白所得到的结果是一致的。

3 结论

本试验通过热处理对卵白蛋白的理化性质及酶解后蛋白的水解度和ACE抑制活性进行了研究。结果表明，当热处理温度为80℃时，ACE抑制活性较高，此条件下蛋白的理化性质与处理前蛋白的理化性质相比，平均粒径减小，表面巯基含量增加但总巯基含量降低，表面疏水性降低，荧光强度增加且最大吸收峰发生蓝移。由此可见，热处理能有效地改变蛋白质的理化性质，这可能使碱性蛋白酶的作用位点在一定程度上发生迁移，进而导致酶解后卵白蛋白的ACE抑制活性发生了改变。