四种防霉剂及其复配对黄曲霉菌抑制效果的研究

靳双星，杨金佩，王 强，张桂枝

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046；3.广州智龙生物科技有限公司，广东 广州 510032)

黄曲霉菌是一种常见腐生真菌，30%～60%的菌株能产生有致癌作用的黄曲霉毒素。近年来我国饲料和饲料原料中黄曲霉菌及其毒素的检出率较高，超标十分严重。郭志青[1]对山东省9个花生主产区的土壤、花生荚果及花生仁进行采样检测，不同产区土壤、花生荚果中黄曲霉菌的检出率为7%～18%，花生籽仁中黄曲霉毒素的含量为5.01～26.80 μg/kg。陈丽媛[2]对2018年的玉米、小麦、麸皮等饲料原料样品进行检测，黄曲霉毒素B1的检出率为100%，样本含量平均值为10.01 μg/kg，最高值达79.55 μg/kg，远远超过国家规定的限量标准。

黄曲霉毒素主要攻击动物的肝脏，降低其免疫能力，使动物对病原微生物的易感性增加。饲料防霉剂是一类能降低饲料中霉菌数量、抑制霉菌毒素产生、防止饲料霉变的饲料添加剂[3]。目前常用的防霉剂主要分为有机酸防霉剂、有机酸盐防霉剂和复合防霉剂三类[4]。本试验研究双乙酸钠、丁酸钠、丙酸钙和山梨酸钾等四种有机酸盐防霉剂及其复配制剂对黄曲霉菌生长的抑制效果，旨在为有机酸盐防霉剂在饲料工业中的应用提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

ATCC28539型黄曲霉菌株购自上海北思生物公司。

1.1.2 药品

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和RPMI1640培养基购自南京建成生物工程研究所。双乙酸钠(含量不低于99%)、丙酸钙(含量不低于98%)、丁酸钠(含量不低于98%)和山梨酸钾(含量不低于98%)均购自河南省万家标准物质研发中心有限公司。

1.1.3 主要仪器

FA2204N型分析天平、DH6000II型电热恒温培养箱、YXQ-LS-100型高压灭菌锅、SW-CJ-2FD型超净工作台、WYS-03B型双目生物显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

取黄曲霉菌标准菌株，加活化液体培养基500 μL，摇晃溶解后用接种环挑取菌液，划线接种于PDA平皿上，28 ℃ 培养3～4 d。用接种环挑取单个菌落，在平板上划线培养，2～3 d以后在培养基中加入适量RPMI1640培养液进行冲洗，用移液枪吹打使黄曲霉菌的孢子悬浮于培养液中。

1.2.2 孢子计数和试验菌液的配制

收集黄曲霉菌孢子溶液，8 000 r/min离心5 min，用无菌纱布过滤3次除去菌丝，备用。吸取黄曲霉菌孢子菌液滴于血细胞计数板中，在光学显微镜下计数，然后加入适量RPMI1640培养液，调整菌液浓度为1×103～5×103cfu/mL，置 4 ℃ 冰箱保存备用。

1.2.3 有机酸盐防霉剂的配制

用电子天平称取适量的双乙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾和丁酸钠，用灭菌的蒸馏水配制成质量浓度均为128 mg/mL的溶液，经0.22 μm 滤膜过滤后分装于灭菌小瓶中，置4 ℃ 冰箱保存备用。

1.2.4 最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC)的测定

参照美国临床标准化委员会(CLSI)提出的丝状真菌药物敏感试验方案[5]，采用二倍逐级稀释法测定4种有机酸盐防霉剂对黄曲霉菌的MIC，以无培养物生长的最低药物质量浓度为MIC，每种防霉剂试验重复3次，取平均数。

1.2.5 最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration, MBC)和杀菌率测定

从每个试验孔中取出培养液100 μL，加入PDA培养基中，采用灭菌的涂布棒涂布均匀。将平板倒置于恒温培养箱内，28 ℃培养3 d，观察并记录数据。以平板上没有菌落生长的最小药物质量浓度为MBC，有菌落生长的平板进行菌落计数，计算杀菌率。杀菌率=(阳性对照组菌落数-试验组菌落数)/阳性对照组菌落数×100%。

1.2.6 联合抑菌试验

选取抑菌效果最好的一种防霉剂(双乙酸钠)，与其他3种防霉剂按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例复配，测定每种复配制剂的MIC，操作方法同1.2.4，每组试验重复3次，取平均数。计算联合抑菌指数即分级抑菌指数(Fractional inhibitory concentration, FIC)。FIC= A药联合时MIC/A药单独用药 MIC+B 药联合时 MIC/B 药单独用药 MIC。FIC≤0.5为协同作用，0.52 为拮抗作用。

2 结果

2.1 MIC测定结果

4种有机酸盐防霉剂对黄曲霉菌的体外生长均有抑制作用，双乙酸钠和丁酸钠的MIC均为32.00 mg/mL，丙酸钙和山梨酸钾的MIC均为64.00 mg/mL。

2.2 MBC和杀菌率

四种有机酸盐防霉剂对黄曲霉菌的杀菌率见表1。由表1可知，有机酸盐防霉剂对黄曲霉菌的杀菌效果随质量浓度的增加而增强。四种有机酸盐中以双乙酸钠对黄曲霉菌的杀菌效果最佳，其MBC为32 mg/mL，当双乙酸钠的质量浓度为16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL和2 mg/mL时，其对黄曲霉菌的杀菌率分别为98.6%、95.0%、92.1%和80%。丁酸钠对黄曲霉菌的杀菌效果次之，其MBC为32 mg/mL，当丁酸钠的质量浓度为16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL和2 mg/mL时，其对黄曲霉菌的杀菌率分别为91.2%、84.4%、72.0%和54.1%。丙酸钙的MBC为64 mg/mL，当丙酸钙的质量浓度为32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL和4 mg/mL时，对黄曲霉菌的杀菌率分别为93.0%、90.0%、66.7%和42.6%。山梨酸钾对黄曲霉菌的杀菌效果最差，其MBC为128 mg/mL，当山利酸钾的质量浓度为64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL和8 mg/mL时，对黄曲霉菌的杀菌率分别为99.9%、90.0%、66.7%和42.0%。

表1 4种防霉剂对黄曲霉菌的杀菌率

2.3 双乙酸钠与丁酸钠复配联合抑菌效果

双乙酸钠与丁酸钠按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例复配，混合液的MIC和FIC见表2。由表2可知，在双乙酸钠与丁酸钠的9种配比混合液中，除1：4配比混合液的MIC为16 mg/mL外，其余8种配比混合液的MIC≤8 mg/mL，显著低于双乙酸钠单用(32 mg/mL)和丁酸钠单用(32 mg/mL)的MIC。FIC值均小于或等于0.5，说明两种有机酸盐复配对黄曲霉菌的抑制有协同作用。双乙酸钠与丁酸钠配比为 3：1 和4：1时混合液的MIC均为4 mg/mL，FIC值为0.125，配比较佳。

表2 双乙酸钠与丁酸钠联合对黄曲霉菌的抑制效果

2.4 双乙酸钠与丙酸钙复配联合抑菌效果

双乙酸钠与丙酸钙按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例复配，混合液MIC和FIC见表3。由表3可知，双乙酸钠与丙酸钙的9种配比混合液的MIC≤32 mg/mL，其中双乙酸钠与丙酸钙配比为3：1和4：1时，混合液的MIC为8 mg/mL，显著低于双乙酸钠单用(32 mg/mL)和丙酸钙单用(64 mg/mL)的MIC。双乙酸钠与丙酸钙配比为3：1和4：1时，FIC值分别为 0.219 和0.225，均小于0.5，说明双乙酸钠与丙酸钙复配对黄曲霉菌的抑制有协同作用，配比较佳。

表3 双乙酸钠与丙酸钙联合对黄曲霉菌的抑制效果

2.5 双乙酸钠与山梨酸钾复配联合抑菌效果

双乙酸钠与山梨酸钾按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例复配，混合液MIC和FIC见表4。由表4可知，双乙酸钠与山梨酸钾的9种配比混合液的MIC均远小于双乙酸钠单用(32 mg/mL)和山梨酸钾单用(64 mg/mL)的MIC。FIC值均小于0.5，说明双乙酸钠与山梨酸钾复配对黄曲霉菌的抑制有协同作用。双乙酸钠与山梨酸钾配比为2：1时，FIC值只有0.026，混合液MIC为1 mg/mL，配比最佳。

表5 双乙酸钠与山梨酸钾联合对黄曲霉菌的抑制效果

3 讨论

本试验结果表明，双乙酸钠、丁酸钠、丙酸钙和山梨酸钾等四种有机酸防霉剂对黄曲霉菌的生长均有抑制作用，抑菌效果随着防霉剂质量浓度的增加而增强，达到一定的质量浓度后有完全的杀菌作用，其中以双乙酸钠的抑制效果最佳，其次是丁酸钠。

杨晓丽等[6]报道双乙酸钠对黑曲霉、黑根霉、黄曲霉和黄青霉的抑制效果优于山梨酸钾，双乙酸钠对黑根霉的防霉效果比对黄青霉和黄曲霉的防霉效果好。葛明兰等[7]报道双乙酸钠和苯甲酸均对黄曲霉菌有抑制作用，双乙酸钠的抑菌效果优于苯甲酸。张铮等[8]比较了丙酸钙、柠檬酸、双乙酸钠和山梨酸钾对非密封状态下乳酸菌发酵饲料的防霉效果，发现双乙酸钠和丙酸钙的抑菌效果优于山梨酸钾和柠檬酸，2%丙酸钙和0.3%双乙酸钠的防霉效果较佳。王子苑等[9]报道日粮中添加双乙酸钠能改善发酵全混合日粮的品质，抑制霉菌的繁殖，减少干物质的损失。上述研究证实，双乙酸钠是一种安全、高效的防霉添加剂。双乙酸钠作为饲料添加剂，除具有抑菌、防霉作用外，还有提高饲料的蛋白质利用率、改善饲料报酬和促生长等功效。在家禽饲粮中添加双乙酸钠能提高雏鸡的存活率和蛋鸡的产蛋率[10]。在肉鸭饲粮中添加双乙酸钠能促进肉鸭生长，提高饲料转化率和经济效益[11]。在断奶仔猪饲粮中添加双乙酸钠能促进肠道健康，提高养分消化率、日增重和胴体瘦肉率[12]。

丁酸钠的抑制效果仅次于双乙酸钠。王曼曼等[13]报道丁酸钠不是通过改变菌体pH值来抑制细菌增长，而是通过自身的溶解发挥抑菌作用。丁酸钠作为饲料添加剂，除具有抑菌、防霉作用外，还具有维持肠道平衡、改善小肠形态、促进小肠吸收、增强机体免疫力等功能。丁酸钠作为短链脂肪酸可以为肠道提供部分能量，当畜禽因应激发生肠道损伤时，丁酸钠有助于恢复肠道的健康。在日粮中添加一定量的丁酸钠可以增加肠道内免疫细胞数量，从而增强肠道免疫反应[14]。

双乙酸钠与其他3种防霉剂按照不同比例复配，以双乙酸钠与山梨酸钾复配效果最佳。双乙酸钠与山梨酸钾配比为2：1时，混合液的MIC为1 mg/mL，FIC值为0.026；双乙酸钠与丁酸钠配比为3：1和4：1时，混合液的MIC均为4 mg/mL，FIC值为0.125；双乙酸钠与丙酸钙配比为3：1和4：1时，混合液的MIC均为8 mg/mL，FIC值为0.219和0.225。上述试验结果表明，双乙酸钠与其他三种防霉剂复配对黄曲霉菌的抑制作用显著增强。徐铠煜等[15]采用抑菌圈法研究了复配型防霉剂对十种粮食霉菌的抑制效果，发现双乙酸钠与山梨酸钾的复配效果明显优于双乙酸纳与丙酸钙的复配效果，相比于双乙酸钠、山梨酸钾和丙酸钙单独使用，双乙酸钠与山梨酸钾复配也有明显的增效作用，这与本试验的结果一致。

4 结论

双乙酸钠、丁酸钠、丙酸钙和山梨酸钾等四种防霉剂对黄曲霉菌的体外生长均有一定的抑制作用，以双乙酸钠对黄曲霉菌的抑菌效果最强，防霉剂对黄曲霉菌的抑制效果随着质量浓度的升高而增强。双乙酸钠与其他三种药物复配后对黄曲霉菌的抑制均有显著的协同作用，以双乙酸钠与山梨酸钾按照2：1比例复配效果最佳。