肺栓塞患者补体相关基因mRNA的表达特征

吕 炜, 王乐民, 宋浩明

(1. 天津市第一中心医院 心内科, 天津, 300192; 2. 同济大学附属同济医院 心内科, 上海, 200065)

肺栓塞(PE)具有高发病率、高病死率、高误诊率以及高漏诊率等特点[1]。静脉血栓栓塞症(VTE)包括深静脉血栓形成(DVT)和PE[2]。Grimnes G等[3]报道PE的发生与感染相关。有研究[4]还报道症状性PE患者自然杀伤(NK)细胞相关基因mRNA表达显著下降。研究[5]报道急性PE与慢性血栓栓塞肺动脉高压(CTEPH)均存在T细胞免疫功能下降的情况。上述研究均表明PE的发生、发展过程与免疫密切相关，包括固有免疫和适应性免疫。

在体内免疫系统对抗病原体的过程中，补体系统在固有免疫和适应性免疫中起着重要的免疫防御作用[6]。补体系统由30余种蛋白组成，其中包括补体固有成分、受体以及调节蛋白。目前，临床上整体检测补体系统的所有蛋白水平是很困难的。本研究采用全人类基因组芯片技术，系统地分析症状性PE患者外周血单个核细胞(PBMC)补体系统相关基因mRNA的表达特征，从基因层面上研究症状性PE患者补体系统的功能特点，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016—2018年同济大学附属同济医院住院的20例PE确诊患者为PE组，其中男11例，女9例，年龄44～89岁，平均(69.80±14.26)岁; CTEPH患者3例; PE中3例确诊合并下肢DVT。PE诊断标准: ① 肺动脉造影证实肺动脉阻塞或充盈缺损; ② 肺通气/灌注扫描提示通气正常或不正常，通气/灌注比值不匹配、单发或多发血流灌注缺损; ③ 具有PE相关危险因素和临床表现，经心电图以及胸片排除其他心肺疾病, D-二聚体水平大于0.3 mg/L(呈阳性)，动脉血气分析提示低氧血症，超声心动图、胸部计算机断层扫描、肺血管计算机断层血管扫描等相结合支持PE诊断者。符合上述标准中任意1项即可确诊PE。

选取同期入住本院心内科患者20例为对照组，其中男11例，女9例，年龄44～91岁，平均(71.50±13.89)岁，与PE组年龄、性别匹配。对照组患者排除了肿瘤、自身免疫性疾病、DVT、PE、先天性凝血功能异常以及动脉血栓等疾病。PE组与对照组年龄无显著差异(P>0.05)。本研究征得2组受试者知情同意，已得到同济大学医学伦理委员会的授权。

1.2 研究方法

收集2组受试者的心功能分级[美国纽约心脏病协会(NYHA)分级]、血生化指标、肺通气/灌注扫描或肺血管CT等检查结果。

1.2.1 器材与标本收集: 本研究应用的基因芯片由Agilent公司(美国)提供，芯片型号为G4112F, 为人类全基因组oligo芯片，芯片70%的基因功能已明确。包括44 290个探针，其中41 675个人类基因或转录本、1 942个阳性质控点、314个阴性质控点、359个空白点构成该基因芯片探针。收集PE组及对照组外周静脉血5 mL, 存入含有ETDA抗凝管中待检。

1.2.2 受试者血液总RNA的抽提及纯化: 对2组受试者外周静脉血PBMC进行红细胞裂解液分离。使用Trizol法抽提PBMC的总RNA, 使用琼脂糖凝胶电泳和LAB-on-chip电泳鉴定其总RNA质量。使用QIAGEN RNeasy柱进行纯化。

1.2.3 受试者基因表达检测: 将提取的受试者总RNA反转录合成双链cDNA, 并进行纯化，带有生物标记(Cy3)的cRNA在体外转录合成。探针芯片与Cy3NHSester荧光标记的cRNA进行杂交、洗涤。Agilent扫描仪扫描后获取图像。原始的数据由GeneSpring GX软件进行读取，进行标准化处理，最后得到标准化信号值。

1.2.4 RT-PCR: 在基因芯片中检测出的差异表达基因里抽取3条基因(CCL3L3、ZNF683、LBA1), 与管家基因GAPDH进行实时荧光定量 PCR(RT-PCR)。待测基因相对表达量为待测基因和内参GAPDH基因的起始拷贝数之比，待测基因相对拷贝数等于2-ΔΔCt。经过分析，使用2-ΔΔCt法计算2组的差异表达，从而证实RT-PCR结果和芯片的实验结果基因相一致。

从全基因表达的结果中收集补体系统相关基因mRNA表达数据。PE组患者按照指南给予正规诊治，并进行随访，了解患者的病情变化以及用药情况。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0软件对2组的数据进行统计学分析，所有数据采用均值±标准差表示，统计方法为两样本随机方差模型校正的t检验，以筛选出差异表达的基因,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2组受试者基本情况比较

2组受试者年龄、性别无显著差异(P>0.05), PE组D-二聚体、肌钙蛋白水平均显著高于对照组(P<0.01), 2组NYHA心功能分级无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 2组受试者一般情况比较

与对照组比较, **P<0.01。

2.2 2组外周血中PBMC补体系统固有成分基因mRNA的表达比较

结果显示，在14条补体系统前端固有成分基因mRNA的表达比较中, PE组共4条基因表达显著上调(P<0.01), 包括C1QA、C1QB、C4B和CFP, 2条基因的mRNA表达显著下调(P<0.05), 包括MBL2、MASP1。见图1。在7条补体系统终末固有成分基因mRNA的表达比较中, PE组补体成分C5 mRNA表达显著上调(P<0.05), C7、C9 mRNA表达显著下调(P<0.05), C6 mRNA表达显著下调(P<0.01)。见图2。

与对照组比较, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01。图1 2组外周血中PBMC补体系统前端固有成分基因mRNA的表达比较

与对照组比较, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01。图2 2组外周血中PBMC补体固有成分终末成分的mRNA表达比较

2.3 2组外周血中PBMC补体系统受体相关基因mRNA的表达比较

本研究共筛选出7条补体受体相关基因。PE组中共4条基因mRNA的表达显著上调(P<0.01), 包括CR1、ITGAX、ITGAM、C5AR1。见图3。CR3由ITGAM和ITGB2构成, CR4由ITGAX和ITGB2构成。

与对照组比较, ∗∗P<0.01。图3 2组外周血中PBMC补体系统受体相关基因mRNA的表达比较

2.4 2组外周血中PBMC补体调节蛋白基因mRNA表达比较

本研究共筛选出补体调节蛋白基因7条。PE组CD59基因mRNA表达显著上调(P<0.05), CD55基因mRNA表达显著上调(P<0.01), CFI基因mRNA表达显著下调(P<0.05)。见图4。

与对照组比较, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01。图4 2组外周血中PBMC补体调节蛋白的mRNA表达比较

2.5 随访情况

对PE组患者进行随访，对患者严格按照指南进行治疗，以抗凝治疗为主。治疗后, PE患者症状及NYHA心功能分级较治疗前有明显改善。

3 讨 论

补体的激活途径共3种，即经典途径、凝集素途径和替代途径。补体的3条激活途径共同的末端通路形成膜攻击复合物(MAC), MAC能够发挥溶细胞效应及免疫防御作用[7]。

本研究检测补体3条途径的前端成分基因共14条, PE组4条基因的mRNA表达显著上调(P<0.01), 包括C1QA、C1QB、CFP、C4B, 而MBL2、MASP1的mRNA表达显著下调(P<0.05)。PE组C1QA、C1QB、C4B的表达上调提示PE患者的体内存在外界病原体入侵，能够导致经典途径的激活。甘露糖相关的丝氨酸蛋白酶(MASPs)激活后导致MBL途径激活[8]。研究[9-10]表明MBL缺乏的患者易发生各种感染，尤其当其适应性免疫还不够成熟时。PE组的MBL、MASP-1 mRNA表达均下调，提示PE患者MBL途径免疫功能发生了缺陷。

MAC形成起始于C5b，包括了C5b、C6、C7、C8以及多分子C9[6]。研究[11]表明，C5、C6、C7、C8或C9的缺陷会增强患者对感染的易感性。本研究共检测补体固有成分终末成分基因7条, PE组患者的C6、C7和C9 mRNA的表达较对照均显著下调，提示PE患者对于感染的病原微生物溶细胞能力下降。本研究还检测了7条补体受体基因, PE组中CR1、CR3的ITGAM、CR4的ITGAX以及C5AR1较对照组均显著上调，提示多种补体效应分子(C3b、iC3b、C5a)与其受体反应增强。

本研究检测补体调节蛋白基因共7条，其中PE组中上调基因为CD59(P<0.05), CD55(P<0.01), CFI基因mRNA表达显著下调(P<0.05)。CD55、C4结合蛋白(C4BP)和H因子能通过抑制C3转化酶活性调节补体的激活[6]。CD59能在MAC的形成过程中与C8(α链)和C9结合，阻止MAC介导的细胞溶解效应[12]。本研究中，与对照组比较, PE组患者CD55、CD59(MIRL)mRNA的表达显著上调，提示PE患者中由补体系统介导的溶细胞作用受到了抑制。本研究中, CD55与CD59基因mRNA显著上调，原因尚不清楚。有研究[13]报道, I因子缺乏与反复细菌感染密切相关。本研究中, PE组I因子mRNA表达较对照组显著下调，提示PE患者对细菌感染易感性增强。

本研究PE患者补体系统的多种途径和环节中补体成分mRNA表达出现失衡，提示补体系统功能中某些环节增强，而某些环节发生缺陷。固有免疫包括吞噬细胞、NK细胞和补体系统，而适应性免疫包括T细胞和B细胞。既往研究[14]曾报道静脉血栓栓塞症患者CD3+、CD8+T细胞功能下降，CD4+/CD8+发生失衡。本研究中，PE患者的经典途径及替代途径中某些前端成分及补体受体存在mRNA表达上调，提示PE患者中存在补体的激活。而在MBL途径以及补体激活途径的末端通路MAC的形成中存在mRNA水平下降，提示PE患者存在补体功能缺陷。作者推测当固有免疫与适应性免疫存在联合缺陷时，固有与适应性免疫防御均不能有效地清除体内的病原微生物，病原微生物会随着血液循环直接或间接地激活凝血功能，最终导致症状性PE的发生、发展。因此，症状性PE可能是与机体内免疫系统联合缺陷密切相关的疾病。