基于网络药理学探究莲子心治疗高血压的分子机制

占秋晓，李丹丹，刘 璐，鞠春晓，薛 冰，徐凤芹

高血压以体循环动脉压升高为特征，并可伴随心、脑、肾等靶器官损害。我国高血压诊断标准为收缩压≥140mmHg(1mmHg=0.133kPa)和(或)舒缩压≥90 mmHg[1]，而在最新版美国高血压指南[2-3]中，其诊断标准更为严格。高血压的病因和发病机制极其复杂，在高血压的治疗过程中，单一靶向某一特定靶点或某一特定因素有时并不能将血压控制在满意范围，对于一些顽固高血压病人需要3种甚至4种降压药连用。中药具有多组分、多靶点的特点，在治疗高血压等由多基因、多因素导致的疾病中具有优势。

中医学中并没有高血压这一特定病名，按照症状，高血压在中医学分属“眩晕”“头痛”“中风”等范畴。中医学将高血压分为肝阳上亢、痰湿内盛、瘀血内停、肝肾阴虚及肾阳虚衰5个证型，治疗时病证结合、辨证施治。莲子心为睡莲科植物莲成熟种子的绿色胚芽，其味苦、性寒，能清心安神、交通心肾、涩精止血，可用于热入心包、神昏谵语、心肾不交、失眠遗精、血热吐血等症治疗中。中医学在长期的临床实践中也发现莲子心具有治疗高血压的作用，这在雷燕等[4]临床研究中得到证实，此外在高枫等[5]关于高血压合并动脉粥样硬化的临床实验中，也发现莲子心在治疗高血压的同时还具有抗粥样硬化作用。网络药理学是基于系统生物学理论，对特定生物系统进行网络分析，用于辅助新药研发的一种方法。通过借助网络药理学方法不仅可以辅助了解中药的毒副作用，探索中药的治疗机制，还有助于中药现代化为临床用药提供参考价值[6]。本研究借助网络药理学的研究方法探讨莲子心治疗高血压的可能机制，以期为后续基础研究及临床用药提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 筛选活性成分，构建化合物-靶点网络 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)是一个为中药研究提供在线中药化学组成、毒药物动力学(absorption，distribution， metabolism and excretion， ADME)、作用靶点等信息，并捕捉靶点与疾病之间关系的药理学平台，其涵盖了449味中药数据，通过在TCMSP中输入需要检索单味中药可以较全面地检索到其化学组分及作用靶点等信息[7]。BATMAN-TCM (a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine， BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)也是一个专门用于研究中药作用靶点的在线生物信息学分析工具[8]。UniProt(Universal Protein， UniProt)(http://www.uniprot.org/)整合了多个数据库的信息，是一个免费在线的较为丰富全面的蛋白数据库。通过借助上述3个平台，在TCMSP及BATMAN-TCM两个数据库中检索莲子心的化学组成及靶点蛋白信息。随后将得到的靶点蛋白信息输入UniProt数据库，在库中检索靶点蛋白所对应的靶基因名称，并通过Cytoscape3.6.1软件构建“药物-靶点网络”。

1.2 构建疾病-靶点网络 治疗靶标数据库(Therapeutic Target Database， TTD)(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、比较毒物遗传数据库(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)(http://ctdbase.org/)及DRUGBANK数据库(https://www.drugbank.ca/)是面向医药等研究领域，并提供疾病、治疗靶点及相应药物的综合信息平台。通过借助上述3个数据库，检索高血压疾病目前已被证实有治疗作用的靶点，并借助Cytoscape3.6.1软件绘制“疾病-靶点网络”。

1.3 构建药物-靶点-疾病网络及蛋白互作网络 通过Cytoscape3.6.1将“药物-靶点网络”与“疾病-靶点网络”进行合并，筛选出药物作用靶点中与高血压治疗靶点重合的靶点，即关键靶点。String 数据库(https://string-db.org/)是一个在线搜索已知蛋白质直接或间接相互作用的数据库，可用于构建蛋白互作(protein protein interaction，PPI)网络[9]。借助String 数据库，输入上述关键靶点，物种限定设置为人类，随后进行PPI网络构建与分析。

1.4 GO功能注释及KEGG通路富集 注释、可视化和集成发现的数据库(The Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery， DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)能对输入的基因列表进行分析，从而得到与之相关的基因本体(gene ontology，GO)功能注释信息及基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)通路信息[10]。在上述数据库中输入关键靶点的基因信息，并对上述关键靶点基因进行GO功能注释及KEGG通路富集。

2 结 果

2.1 莲子心活性成分-靶点网络构建 经TCMSP及BATMAN-TCM数据库检索莲子心活性成分，其中TCMSP数据库共检索出31种活性成分，BATMAN-TCM检索出19种活性成分，剔除掉两数据库重复及无作用靶点的25种活性成分，最后筛选得到25种有效活性成分，共588个作用靶点，图1为构建的药物靶点网络图。表1中仅列出靶点数量排名前10位的活性成分。

图1 莲子心活性成分-靶点网络图

表1 莲子心中靶点数量排前10位的活性成分

2.2 高血压-靶点网络构建 经检索，TTD中共检索出与高血压相关的靶点57个，CTD中共检索出与高血压相关的靶点205个，DRUGBANK数据库中共检索出与高血压相关的靶点172个，将上述靶蛋白输入UniProt数据库并剔除重复的靶点，最后共得到212个与高血压相关的治疗靶点。通过Cytoscape3.6.1构建高血压-靶点网络。详见图2。

图2 高血压-靶点网络图

2.3 高血压-靶点-莲子心网络构建 将莲子心-靶点网络与高血压-靶点网络进行合并，共得到59个关键靶点，并构建高血压-靶点-莲子心网络(见图3)。59个关键靶点通过String数据库构建的PPI网络见图4。

图3 高血压-靶点-莲子心网络图

图4 关键靶点PPI网络

2.4 GO功能注释及KEGG通路富集 在DAVID中对上述关键靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集，P值越小意味着相关度越高，根据P值进行排序。图5为细胞定位、分子功能和生物学过程的GO功能注释结果，图6为KEGG通路富集结果，均依据P值大小，选择P值最小即相关度最高的10位。图7为作用于神经递质通路关键靶点的细胞定位。

图5 GO功能注释

图6 KEGG通路富集

图7 多种神经递质通路中关键靶点的细胞定位

3 讨 论

借助网络药理学方法，莲子心中共筛选出25种活性成分及588个作用靶点，其中59个作用靶点与高血压的治疗靶点一致，即关键靶点。通过对上述59个关键靶点进行GO功能注释及KEGG通路分析，按照P值进行排名，P值越小排名越靠前，筛选出排名前10位的GO功能注释及KEGG通路。通过对细胞学组分(cellular components，CC)、分子生物学功能(molecular function，MF)和生物学过程(biological process，BP)进行功能富集分析，该59个关键靶点主要分布于质膜、突触前膜及突触后膜等部位，具有调控电压门控钾、钙通道活性及肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等多种神经递质受体活性的作用。提示莲子心治疗高血压的机制可能涉及膜电位的去极化、血管平滑肌张力的调节、心肌舒张功能及心率的调节、多种神经递质的信号转导等生物学过程。通过对KEGG信号通路进行

富集分析，莲子心治疗高血压的机制可能涉及多种神经递质通路、钙信号通路、cGMP-PKG通路等。

高血压的治疗目的在于控制血压及保护靶器官，血压的持续升高往往涉及一个或多个生理调控系统失调。这些影响血压的调控系统涉及共同的最终通路，包括中枢及交感神经系统的激活、血管的收缩、肾脏排钠的调节等，此外炎症与免疫也参与了血压的调控过程[11-12]。钙离子及内皮细胞的参与在上述过程中起了重要作用，其中，钙离子不仅可以通过调控血管平滑肌的张力参与血压的调节，还可以通过改善心肌舒张功能从而起到保护心肌的作用；NO作为一种血管活性物质主要由内皮细胞产生，NO通过激活cGMP-PKG信号通路可使血管平滑肌舒张。而在早期关于莲子心降压或改善高血压靶器官损害的基础研究中，认为其治疗高血压的机制可能是通过阻断α肾上腺素受体及钙拮抗[13]、清除氧自由基及抗氧化[14]、影响心肌肌浆

网钙泵活力[15]，从而起到调控血压和保护靶器官等作用，近年研究发现，莲子心对血管内皮也有保护作用[16]。这与通过网络药理学预测得到的关于莲子心治疗高血压的可能机制是一致的。

中医学将高血压分为5个证型，其中肝阳上亢最为多见[17]，病人表现为头晕、头痛、面红、脾气急躁、易怒、舌红苔黄、脉弦细，即大多数高血压病人伴有急躁、易怒等情志的改变。将多巴胺、5-羟色胺等多种神经递质通路上的关键靶点进行细胞定位分析，发现主要是位于钙离子通道上的各种受体亚基以及位于突触后膜的5-羟色胺及多巴胺受体。5-羟色胺[18]和多巴胺[19]作为神经系统重要神经递质，它们均参与了情绪调控的生物过程。突触前膜内囊泡递质的释放呈钙离子依赖的量子式释放，位于突触前膜的钙离子通道活性的改变可以影响5-羟色胺及多巴胺等递质的释放并进而调控情绪，而位于突触后膜的5-羟色胺及多巴胺受体活性的改变也可以影响情绪[20]。结合网络药理学分析结果，莲子心或许可以通过调控递质释放及突触后膜受体活性而改善高血压病人急躁、易怒等情绪症状。这为后续探讨莲子心治疗高血压的同时是否能改善高血压病人伴有的情绪症状提供了思考方向。