葡萄糖激酶调节蛋白基因rs780094多态性与冠心病痰瘀互阻证的关系探讨

庞 博，谷 春，吴 敏，武庆娟，邓雅文，侯雪筠，叶红蕾，杨忖卿，李 军，刘贵建

葡萄糖激酶调节蛋白(glucokinase regulatory protein， GCKR)基因位于人类染色体2p23.3上，共有19个外显子，全长27 078 bp，编码大小约为68 kD的蛋白质。GCKR可与葡萄糖激酶(glucokinase， GCK)结合并抑制后者的活性，而GCK对于血糖调节十分重要[1-3]。GCKR基因上的一些多态性位点可以影响GCKR表达的高低，并通过调节GCK影响血浆葡萄糖浓度[4]。因此，GCKR可通过GCK对糖尿病的发生有一定作用，GCKR基因多态性也是发生糖尿病的遗传因素之一[5-6]。

痰瘀互阻证实质研究多集中在冠心病、胰岛素抵抗、脂肪肝等疾病[7-8]。早期识别或防止痰证和瘀证互化互结，从现代医学和客观化的角度理解痰瘀互阻等证候形成机制，对于冠心病的辨证施治十分重要。在冠心病病证结合辨证体系中，痰瘀互阻是其中重要证型之一，在临床上准确进行辨证，并合理运用痰瘀同治的方法，可使此类证型的冠心病病人获得较好疗效[9]。目前，与痰瘀互阻证型相关的客观因素尚不完全清楚，其形成机制有待阐明。基于决策树的识别模式研究发现，空腹血糖可能与冠心病痰瘀互阻证型关系密切[10]。因此，那些可能影响糖代谢的先天因素有可能和冠心病痰瘀互阻证型存在一定关联性。本研究分析GCKR基因rs780094多态性与冠心病痰瘀互阻证的关系，探讨其CC基因型较另两个基因型是否的冠心病病人更易出现痰瘀互阻证型。

1 资料与方法

1.1 研究对象 连续纳入2017年7月—2018年3月在中国中医科学院广安门医院心内科就诊的符合标准的冠心病病人206例，包括稳定型劳力性心绞痛和不稳定型心绞痛病人。冠心病稳定型心绞痛诊断标准参照2007年《慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》。冠心病不稳定心绞痛诊断标准参照2011年ACCF/AHA《不稳定性心绞痛和非ST段抬高性心肌梗死(NSTEMI)指南》，并具有以下其中一项者：①原有的稳定型心绞痛性质改变，即心绞痛频繁发作、程度严重和持续时间延长；②休息时心绞痛发作；③最近1个月内新近发生的、轻微体力活动亦可诱发的心绞痛。参照《中药新药临床研究指导原则》进行中医辨证分型。痰浊主要证候包括：胸闷痛，痰多体胖，舌胖伴苔厚腻，大便黏腻，肢体沉重等。血瘀主要证候包括：胸固定性痛，舌质紫黯或有瘀点、瘀斑，舌下静脉紫黯，面色紫黯，身体出现瘀点或瘀斑等。根据辨证结果将病人分为痰瘀互阻及非痰瘀互阻证两组。辨证过程由两名心血管科专业医师进行，一致者可录入，不一致时则需请上级医师参与辨证分析。本研究经中国中医科学院广安门医院伦理委员会审查通过后进行。将206例冠心病病人辨证分为痰瘀互阻证组(80例)与非痰瘀互阻证组(126例)。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：符合上述诊断标准，年龄35～85岁，签署知情同意书。排除标准：急性心肌梗死；其他心脏先天疾病、瓣膜病、重度神经官能症等所致胸痛者；心功能为Ⅲ级或Ⅳ级者；心律失常引起的胸闷胸痛；脑梗死急性期；合并肝、肾、造血系统等严重原发性疾病；最近2周内有急性感染者；合并其他较严重而必须治疗者(如血液病、肿瘤等)；妊娠或哺乳期妇女。

1.3 观察指标 收集数据包括空腹血糖(GLU)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(ALB) 等指标(应用全自动生化仪Olympus AU5800测定)。

1.4 DNA提取及检测 利用EDTA抗凝全血，用血液基因组DNA提取试剂盒(DP318， TIANGEN， China)进行DNA提取，步骤依据试剂盒说明书进行。按自行设计的冠心病相关SNP panel进行实验，panel中含有rs780094目标检测位点，按照公司(iGeneTech，China)标准方式进行预处理和测序分析。以100 ng的DNA样品作为建库的起始投入量。文库构建试剂盒使用MultipSeq®Custom Panel，每一个样品使用不同的接头，文库构建流程按照厂家说明书进行。首先进行第一轮多重PCR反应，PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min 30 s，98 ℃变性20 s，60 ℃复性、延伸2 min，反应20个循环，72 ℃预延伸5 min。获得的PCR产物用AMPure XP磁珠纯化。加入相应的接头序列进行第2轮PCR反应，PCR反应程序为：95 ℃预变性 3 min 30 s，98 ℃变性20 s，58 ℃复性1 min，72 ℃延伸30 s，反应10个循环，72 ℃预延伸5 min。获得的PCR产物用AMPure XP磁珠纯化。获得的捕获文库进行质检，用Qubit®3.0检测文库的浓度；用Agilent 2100 Bioanalyzer system进行文库片段长度测定。合格文库上机测序，用Illumina NextSeq 500测序仪进行测序，使用Fastp软件对原始数据进行过滤，去除低质量碱基，去除引物序列，获得clean reads，使用Bwa软件将clean reads与GRCh37参考基因组进行比对，去除重复序列，使用GATK软件进行SNV和InDel的检测、注释。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 两组病人在年龄、性别等一般情况方面比较差异无统计学意义，痰瘀互阻证组病人血糖稍高[6.09±2.36)mmol/L 与(5.98±2.13)mmol/L，P=0.574]，三酰甘油稍高于非痰瘀互阻证组，低密度脂蛋白稍低于非痰瘀互阻证组，差异无统计学意义(P>0.05)，检测的其他生化指标比较差异无统计学意义。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 两组GCKR基因rs780094分型比较 冠心病痰瘀互阻证组中，rs780094 CC基因型的比例高于非痰瘀互阻证组(28.75%与 14.29%P=0.013)，其等位基因C的比例也高于非痰瘀互阻证组( 53.75% 与 39.68%P=0.006)。在Hapmap数据库中公布的中国北京汉族人rs780094 CC基因型的比例为14.6%，与本研究中非痰瘀互阻证组CC基因型的比例14.29%非常接近。详见表2。

表2 两组GCKR基因rs780094分型比较 单位：例(%)

2.3 GCKR基因rs780094不同遗传模式与冠心病痰瘀互阻证之间的关系 在累加模型中，按照TT为0，TC为1，CC为2进行赋值，将1和2为设置哑变量后，赋值为1与2的两组分别与赋值最低的第一组进行比较，Logistic回归分析显示，累加模型2中的结果具有统计学意义[OR=3.307， 95%CI(1.438，7.606)，P=0.005]，说明CC与TT相比，与痰瘀互阻证存在显著关联(见表3)，而TC的关联性则未达到统计学意义[OR=1.618， 95%CI(0.815，3.209)，P=0.169]。此外，其显性模型[OR=1.989， 95%CI(1.039，-3.805)，P=0.038]和隐性模型[OR=2.421， 95%CI(1.208，4.852)，P=0.013]也均具有显著相关性。详见表3。

表3 GCKR基因rs780094遗传模式对冠心病痰瘀互阻证影响的Logistic回归分析

3讨 论

随着二代测序技术的发展和人类基因组数据的积累，大量与疾病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， SNP)数据不断涌现，为未来的现代化个体化诊疗提供了可能。中医证候及其要素符合中医的整体观，同样具有鲜明的个体化特征，通过科学的方法将二者融汇，对中西医结合发展非常有益。冠心病病人先天具有某类证候发展倾向性，有可能通过与SNP等大量基因数据关联而获得更好的理解。本研究将冠心病病人分为痰瘀互阻证与非痰瘀互阻证两组，发现GCKR基因rs780094 CC基因型更多地分布于痰瘀互阻证组，提示rs780094 基因型可能与痰瘀互阻证型的形成具有一定关联性。

痰瘀互阻属于本虚标实、虚实夹杂的标实证。机体阳气衰微、气虚或情志不畅，气机郁结，有失运化，津液积聚，形成痰瘀，久之入络，痰瘀交结[11]。按病证结合理论，痰瘀互阻型冠心病应首先符合西医冠心病诊断，除胸闷、胸痛外，同时多伴有体型肥胖，神疲乏力，烦躁失眠，咳嗽痰多，苔白或白腻，舌可有瘀斑，脉弦滑。可伴烦满或抑郁，可有血糖、血脂或血压的升高。《灵枢·百病始生》较早记载了痰瘀的概念，指出： “凝血蕴里而不散，津液涩渗，着而不去，而积皆成矣。”元代朱丹溪则提出“痰夹瘀血，遂成窠囊”，并提出痰瘀同治的方法。

既往已有报道发现，痰瘀互阻证的形成与血糖代谢异常的关系非常密切。从体质方面来看，痰证多与肥胖或高体质指数相关，《黄帝内经》中也有“肥人多痰”的说法。典型的痰证病人多嗜食肥甘厚腻，脾胃运化不利，痰浊壅塞，痰湿内蕴。而肥胖多与胰岛素抵抗、2型糖尿病等相关。有研究显示，痰证与血糖、血胰岛素、胰岛素抵抗指数均呈正相关[12]。此外，瘀证也同样与血糖代谢失调相关。血糖长期过高导致对血管的毒性作用，微血管受损后出现通透性增加，伴有渗出、水肿，甚至出血，导致组织局部炎症，代谢不畅，这些渗出及“离经之血”都是形成瘀的病理基础。病情长期演化，痰瘀相互交结，形成痰瘀互阻证型。因此，血糖代谢异常被认为是痰瘀互阻形成的因素之一[13]。本研究结果显示，痰瘀互阻证组空腹血糖稍高于非痰瘀互阻证组，但未达到统计学意义。这可能与采集的样本量较小以及样本具体特征有关，同时也说明血糖异常可能参与痰瘀互阻证型的形成，但并非唯一要素。

在血糖调节中，GCK是糖代谢的关键调控酶，它可以催化葡萄糖在肝细胞和胰腺β细胞中的磷酸化，同时可作为葡萄糖浓度的感受器，调节胰岛素分泌以及肝糖原合成及糖异生过程。GCKR通过对GCK的特异性抑制，实现其对血糖稳态重要的调节作用。研究表明，GCKR基因的两个单核苷酸位点多态性rs780094和rs1260326存在高度连锁不平衡并与其功能密切相关，后者碱基多态性发生的变化会导致氨基酸的改变，引起GCKR表达水平与活性的显著变化，并使得GCK的亚细胞定位改变，使肝脏葡萄糖代谢出现变化，从而影响血糖水平[14]。已有较多的大样本研究指出，rs780094的CC基因型与代谢综合征及糖尿病发生率升高显著相关。不仅如此，同时rs780094也与病人的多个其他表型或疾病相关，如血脂代谢、冠心病的发生、非酒精性脂肪肝、肝脏酶学变化以及超敏C反应蛋白(hs-CRP)等[15-20]。尽管血糖和血脂检测指标在CC基因型上呈现出相反的趋势，但rs780094与多种疾病表型或检验指标之间的联系仍值得深入研究。本研究结果显示，rs780094的CC基因型与冠心病病人中的痰瘀互阻证关系密切，提示从基因层面上解析中医证候存在着一定的可能性。DNA水平的特征在一定程度上决定了病人的某些先天代谢特性，可能对决定个人体质有重要作用，因此，对于某类证候发生的倾向性可能具有一定贡献作用。rs780094的CC基因型与血糖代谢异常的内在联系可能对于痰瘀互阻形成具有一定作用，但仍不足以对本研究结果进行全面的解释，因此，GCKR rs780094单核苷酸多态性在除血糖外的其他方面影响痰瘀互阻形成的机制和具体分子机制同样值得研究。

本研究存在以下几点局限性：首先，尽管选用了标准化的病证结合辨证体系，但证候的判定仍具有一定的主观性，在辨证体系中如能引入更多客观指标可能会进一步减少主观造成的偏差；其次，痰瘀互阻证的形成可能涉及多个相关基因、环境以及二者的相互作用，并非仅用血糖单一因素或GCKR基因的一个SNP就能得到解释。未来结合多基因、多参数检测指标等大数据，有可能获得更多的痰瘀互阻冠心病的客观证据，并对其形成机制做出很好解释，使中医证候理论与更多客观指标相结合，并结合现代技术得到更好的推广、更科学有效的应用。

本研究通过比较冠心病痰瘀互阻证组与非痰瘀互阻证组病人GCKR rs780094多态性的结果发现，冠心病痰瘀互阻证型与rs780094多态性存在显著关联，这可能与rs780094对糖代谢的影响有关。因此，通过基因水平的研究，可能对于了解冠心病病人出现某种证候的倾向性有一定帮助，该研究结果应当在更大样本中进行验证，并利用更多的基因数据对证候进行研究，基于更客观的证据完善病证结合体系，指导中西医结合诊疗实践。