阿托伐他汀在蛛网膜下腔出血脑血管痉挛中的预防作用机制

侯鹏飞，刘展会，张 睿，程文佳

蛛网膜下腔出血(SAH)主要表现为突发爆裂样头痛，头痛在开始时即达高峰，占所有脑卒中的5%，由于有脑积水、脑血管痉挛(CVS)等众多并发症，所以致死率高[1]。CVS是SAH常见而严重的并发症之一，CVS造成的后遗症和死亡占SAH病人的10%左右[2]。蛛网膜下腔血液及其相应的裂解产物刺激脑血管引起异常收缩，使受累颅内动脉管径变小从而导致供血量减少，出现脑组织缺血损伤，极易导致病人死亡[3]，但迄今为止尚未对其发生的病理生理学机制及其预防、治疗做出明确的阐述[4]。他汀类是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，抑制体内胆固醇合成[5]。大量临床试验证明他汀类药物对冠心病的一级和二级预防有效[6-7]。阿托伐他汀的药理作用广泛，药理学研究显示阿托伐他汀除了具有降脂作用外，还具有抗血小板聚集、清除自由基、调节免疫等作用[8]，同时其在SAH后的血管功能障碍起到保护性作用[9]，但其具体作用机制尚不明确。本研究探讨阿托伐他汀对SAH后CVS的作用和可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物 健康雄性清洁级SD大鼠，购自南京博恩生物技术有限公司，月龄5～8个月，体质量300～350 g。饲养环境温度控制在22～25 ℃，12 h昼夜节律，自由进食和饮水。

1.1.2 药物与试剂 阿托伐他汀(Pfizer)20 mg，β-actin抗体均购自Abcam公司；ELISA试剂盒由上海群己生物科技有限公司提供；内皮素-1(ET-1)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供；核转录因子-κB(NF-κB)试剂盒由上海蔚霆生物科技有限公司提供。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.1.3 主要仪器 Multiskan MK3型酶标仪(美国Thermo-Labsysytems公司)，倒置显微镜(Nikon)，蛋白电泳仪、电转仪(美国Bio-Rad公司)，冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，HE扫描与分析工作站(德国徕卡)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型的建立 54只SD大鼠按照随机数字表法随机分为对照组(18只)、模型组(18只)、治疗组(18只)。治疗组：术前灌胃20 mg/(kg·d)阿托伐他汀，共7 d，采用枕大池二次注血法建立SAH模型[10]，10%水合氯醛麻醉后，将大鼠置于头低位的立体定位框架中，钻孔小脑延髓池，使用导管在60 s内将来自股动脉的自体血(0.2 mL)注射到小脑延髓池中。24 h后通过相同的导管给予第2次血液注射(0.1 mL，30 s)。模型组：模型建立手术操作同治疗组，在建模前后均未应用阿托伐他汀。对照组：大鼠按照治疗组相同步骤接受2次脑池内注射生理盐水，参考Qi等[11]实验剂量，手术操作同治疗组。建模后3 h神经行为评分≥1分的大鼠判定为造模成功。

1.2.2 神经行为学评分 在完成SAH模型24 h评定后对大鼠进行神经行为学评价，参照Bederson方法[12]评定。

1.2.3 基底动脉血管横截面积和血管壁厚度测量 将分离的基底动脉血管制成切片进行HE染色。使用徕卡Aperio Versa微血管分析系统测量血管周长，并计算基底动脉血管横截面积、血管壁厚度。

1.2.4 脑水肿检测 24 h行为学评分结束后，每组取6 只大鼠采用空气栓塞法处死，评估脑含水量。完整分离脑组织，保持蛛网膜完整，测量脑组织湿重，将样品在105 ℃的烘箱中加热24 h，称量脑组织干重。脑水含量的百分比为：(湿重-干重)/湿重×100%。每组使用6只大鼠进行计算。

1.2.5 ET-1蛋白检测 将采集的血液以3 000 r /min离心10 min，取上清液，暂时保存至-20 ℃的冰箱中待测。

1.2.6 蛋白免疫印迹测定 eNOS蛋白和NF-κB蛋白行为学评分结束后，每组取6 只大鼠采用空气栓塞法处死，Western blot 检测eNOS蛋白和NF-κB蛋白表达。取脑组织，于4%多聚甲醛固定24 h标本在电泳前将蛋白样品按5∶1比例加入6×上样缓冲液(loading buffer)，煮沸5 min后用12%聚丙烯胺凝胶电泳。4 ℃条件下23 V电压湿转12 h，预制5%TBS-脱脂奶粉封闭液，室温封闭1 h后加入1∶1 000稀释的eNOS蛋白和NF-κB蛋白抗体或β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗5 min×4次。暗室内浸入ECL液显色，并使胶片曝光，全自动X光洗片机洗片，免疫印迹条带经扫描后用Image J软件分析蛋白相对表达量的灰度分析，测得蛋白表达量与β-actin比对。

2 结 果

2.1 各组神经行为学评分比较 SAH后24 h对大鼠进行神经行为学评分，模型组为(4.8±2.2)分，治疗组为(3.7±1.9)分，对照组为(2.6±1.4)分。模型组与治疗组评分均高于对照组，差异有统计学意义(F=5.34，P=0.02)。

2.2 各组基底动脉血管横截面积比较 对照组基底动脉厚度在3组中最薄； 模型组基底动脉厚度明显增厚；治疗组基底动脉厚度较模型组厚度降低(P<0.05)，仍比对照组厚(P<0.05)。详见图1、表1。

图1 大鼠SAH后24 h基底动脉HE染色切片图(×400)

表1 各组大鼠基底动脉横截面积和血管壁厚度比较(±s)

2.3 各组脑组织水含量比较 对照组大鼠脑组织水分含量为(75.12±3.85)%，模型组脑组织水含量为(86.12±6.78)%，脑水肿较为明显；治疗组脑水肿程度相对于模型组减轻，脑组织水含量为(78.25±3.25)%，3组间比较差异有统计学意义(P=0.01)。

2.4 各组ET-1蛋白表达比较 ELISA检测血管收缩剂ET-1蛋白表达变化，以确定阿托伐他汀对SAH后脑水肿的影响，与对照组(39.72±4.67)pg/mL比较，模型组和治疗组ET-1蛋白表达水平均增加[(85.24±6.25)pg/mL与(62.92±7.27)pg/mL]，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗组ET-1蛋白表达低于模型组(P<0.05)。详见图2。

与对照组比较， *P<0.05；

2.5 各组eNOS蛋白表达情况 eNOS存在于内皮细胞，以促进NO生成。模型组eNOS表达减少，予阿托伐他汀干预后，治疗组与模型组相比eNOS蛋白表达上调(P<0.001)，提示阿托伐他汀可能通过上调eNOS防止CVS。详见图3。

与对照组比较， *P<0.001；

2.6 各组NF-κB蛋白表达情况 NF-κB在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起到关键性作用。模型组与对照组相比，NF-κB蛋白水平上调，引起炎症反应，而治疗组与模型组相比，NF-κB蛋白水平明显下调(P<0.001)。详见图4。

与对照组比较， *P<0.001；

3 讨 论

CVS是SAH的严重并发症，多种因素均可导致颅内动脉收缩，减少动脉供应区域的脑血流量[13]，增高颅内压、氧化应激导致炎症等[14]。阿托伐他汀具有抗炎、稳定斑块、改善内皮细胞功能以及抑制免疫反应等作用[15]。本研究探讨阿托伐他汀对SAH后CVS的作用和分子机制。

本实验结果显示，模型组与对照组相比神经行为学评分升高，而治疗组神经行为评分低于模型组，表明阿托伐他汀可以缓解神经损伤。阿托伐他汀的抗CVS或神经保护功能的基础机制可能是维持血管内皮细胞功能，调节脑血流量，但作用的具体分子机制仍不清楚，血栓调节蛋白(TM)、ET-1均是由血管内皮合成和释放的有效活性肽，并且是内皮功能的标志物。研究表明，ET-1可导致血管收缩和内皮细胞增殖，并且破坏水稳态和血脑屏障完整性，造成脑水肿[16]。在正常的生理条件下，这些细胞因子的表达很少，当生物体被严重刺激或脑内皮细胞自动调节功能受损时， ET-1的表达将增加。因此，ET-1被认为是评价脑内皮细胞功能和脑血管自动调节功能的“金标准”[17]。

本实验表明，阿托伐他汀可减轻SAH后的脑水肿，降低ET-1表达水平，推测阿托伐他汀通过调节ET-1水平缓解脑水肿，修复遭到破坏的血管内皮细胞，这与其在SAH诱导的CVS中的抗痉挛作用相对应[8]。炎症反应导致的神经细胞凋亡在SAH迟发性神经功能缺损的机制中起重要作用。研究表明，p53/NF-κB途径在实验性SAH诱导后的细胞凋亡起着重要作用[18]。作为转录因子，NF-κB参与黏附分子、单核细胞趋化蛋白、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和基质金属蛋白酶(MMPs)的表达调节[19]。最近的研究表明，在炎症作用下，CVS表现出eNOS的下调和NO生物利用度的降低[20]。本实验结果表明，SAH导致NF-κB的表达上调，血管内皮细胞eNOS表达下调。阿托伐他汀干预后下调NF-κB表达，上调eNOS表达，表明阿托伐他汀可以通过抑制炎症介导的细胞凋亡，增加NO的合成抗血管痉挛。

阿托伐他汀可改善大鼠SAH后的CVS，推测可能的机制是由其下调NF-κB、上调eNOS的表达实现的，然而，阿托伐他汀的确切分子作用机制仍有待进一步研究。