肺炎克雷伯菌强毒性血清型分型与ESBLs检测*

马 青，刘 英，王 月，李世军

(贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳 550004)

肺炎克雷伯菌是一种临床常见的条件致病菌之一，为革兰阴性菌，寄居于人体的呼吸道(鼻咽部)、肠道、皮肤等部位，可引起多种感染，在各类临床标本中均有较高的检出率。该菌在健康者口咽部的带菌率为1%～6%，但在住院患者中可高达20%。毒力与耐药性是影响细菌致病性的2个重要因素，在感染中发挥重要作用。本研究收集了从2010年9月至2019年6月“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项的贵阳市5家哨点医院(贵阳市第一人民医院、贵阳市第五人民医院、贵阳市肺科医院、清镇市人民医院和修文县人民医院)发热呼吸道综合征患者的痰标本分离到的17株肺炎克雷伯菌株，对其进行强毒性血清型分型及产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 17株肺炎克雷伯菌株分离自2010年9月至2019年6月“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项的贵阳市5家哨点医院的发热呼吸道综合征患者的痰标本。ESBLs表型确证试验质控菌株：肺炎克雷伯菌菌株ATCC 700603。

1.2仪器与试剂 PCR扩增引物购自中国北京天一辉远公司；PCR扩增试剂2×Taq Plus PCR Master Mix、DNA标志物及琼脂糖等电泳试剂购自中国辽宁大连宝生物公司；标准抗菌药物药敏纸片购自英国Oxoid公司。

1.3方法

1.3.1黏液丝试验 平板培养物挑起的黏液丝长度≥5 mm判为黏液丝试验阳性，需挑起2～3次以确认菌株是否为高黏液表型[1]。

1.3.2DNA模板的制备 水煮法制备DNA模板，100 ℃煮10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR模板，-20 ℃放置备用。

1.3.3多重PCR扩增主要流行高毒力血清型 检测国内主要流行的K1、K2、K5、K20、K54、K57毒力血清型基因。多重PCR 扩增反应体系50 μL，内含 Taqmix 25 μL，12条引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，去离子水18 μL。扩增参数：95 ℃预变性15 min ；94 ℃ 30 s、58 ℃ 90 s、72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳后根据电泳条带大小判断血清型[2]。各血清型引物序列和产物大小见表1。

1.3.4ESBLs检测 应用美国临床和实验室标准协会推荐的ESBLs表型确证试验对肺炎克雷伯菌株进行检测，同时用大肠埃希菌ATCC 25922进行质控。将待测菌制成浊度为0.5麦氏单位的菌悬液，用无菌棉棒均匀涂布于M-H平皿上，把头孢他啶(30 μg)、头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg)、头孢噻肟(30 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(30 μg/10 μg)药敏纸片贴在平皿上35 ℃孵育18～24 h后观察结果。检测结果按美国临床和实验室标准协会判定标准进行判定各平皿上的抑圈直径，抑菌圈直径≥5 mm为产酶株，即ESBLs阳性[3]。

表1 肺炎克雷伯菌高毒力血清型PCR血清分型引物序列和引物大小

2 结 果

2.1黏液丝试验 17株肺炎克雷伯菌株中有8株黏液丝试验阳性，为高黏液表型。

2.2强毒性血清型肺炎克雷伯菌的检出结果 强毒性血清型肺炎克雷伯菌检出率占52.94%(9/17)，其中K1型是主要的流行型别，占47.06%(8/17)； K2型有1株。17株肺炎克雷伯菌各血清型DNA扩增结果见图1。

2.3ESBLs检测 17株肺炎克雷伯菌的ESBLs检出率不高，仅有1株检出ESBLs表型确证试验阳性，此菌株强毒性血清分型结果为K1型，且黏液丝试验为阴性。见图1。

注:M表示DNA标准带；1～17表示17株肺炎克雷伯菌各血清型DNA扩增结果；18表示阴性对照。

图1 肺炎克雷伯菌强毒性血清分型多重PCR电泳结果

3 讨 论

肺炎克雷伯菌作为一种人畜共患的病原菌，广泛分布于自然界，是人和动物呼吸道、肠道的致病菌。肺炎克雷伯菌具有K抗原(荚膜多糖)和O抗原(脂多糖)，其中荚膜多糖是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子之一，根据荚膜多糖结构及其抗原性不同，可将肺炎克雷伯菌分为82个荚膜血清型[4]。其中K1、K2、K5、K20、K54、K57等与人类各种侵袭性感染密切相关，为强毒性血清型肺炎克雷伯菌[5-7]。高毒力肺炎克雷伯菌的生物学特征及临床致病能力与普通肺炎克雷伯菌不同，可引起肺炎、泌尿感染、败血症、肝脓肿等一系列社区获得性疾病。相关报道显示，肺炎克雷伯菌K1、K2型菌株与社区获得性肝脓肿的发生有密切联系[8]。一项研究发现，K1型是导致肺炎克雷伯菌菌血症最常见的血清型，K2型是呼吸道标本中最常见的血清型[9]。但本研究发现痰标本中强毒性肺炎克雷伯菌最多的血清型别为K1型而非K2型，可能存在地区差异。

高毒力和耐药在过去的三十年间被认为不会在同一株肺炎克雷伯菌上表达，但目前在全球范围内强毒性肺炎克雷伯菌获得性耐药的情况日益增加[10]。本研究中有1株K1型肺炎克雷伯菌在不具高黏液表型的条件下产ESBLs，提示对临床症状符合强毒性肺炎克雷伯菌感染特性但黏液丝实验阴性的菌株也应警惕，避免根据黏液表型对肺炎克雷伯菌进行分类，可能会出现强毒性肺炎克雷伯菌漏检的情况。此株产ESBLs的K1型肺炎克雷伯菌分离自一位临床诊断为重症肺炎的死亡病例，提示对既产ESBLs同时又具高毒力的肺炎克雷伯菌在临床上应高度重视。本研究发现8株黏液丝试验阳性的肺炎克雷伯菌株中有1株不属于强毒性血清型，9株强毒性血清型菌株中有2株不具有高黏性，这表明并非所有的强毒性肺炎克雷伯菌都具有高黏性，也并非所有高黏性的肺炎克雷伯菌都具有高毒力。

本研究分析了肺炎克雷伯菌临床分离株的生化和分子特征，提示实验室应注意检测肺炎克雷伯菌黏液性状、荚膜血清型和产ESBLs情况，从而帮助临床医生正确识别高致病性肺炎克雷伯菌导致的感染。目前高致病性肺炎克雷伯菌分离率较高，其耐药株的暴发可能会导致极高的病死率，因此临床上应及时进行监控和干预。虽然本研究检出产ESBLs肺炎克雷伯菌株只有1株，但随着抗菌药物的广泛应用，临床上检出产ESBLs的细菌呈逐年上升趋势的情况不容忽视。