BioPlex 2200全自动免疫分析仪检测血清中抗双链DNA抗体的临床应用*

刘惠源，张 伟，魏雅稚，张允奇，扶忠超，尹志华，叶志中△

(1.深圳市福田区风湿病专科医院风湿免疫实验室，广东深圳 518040；2.深圳市罗湖区人民医院风湿免疫科，广东深圳 518040)

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，本病好发于育龄期女性，临床表现多样，多种自身抗体的出现是SLE的重要特征。其中抗双链DNA(dsDNA)抗体是公认的与SLE病情活动相关的指标，其特异度为95%，灵敏度为70%[1]，抗体效价随疾病活动度缓解而下降，甚至转阴。抗dsDNA抗体常用于监测疾病活动性、药物治疗效果及评价预后。检测方法多种，《抗核抗体谱检测的临床应用专家共识2018年》指出抗dsDNA抗体检测常用的方法包括使用绿蝇短膜虫为实验基质的间接免疫荧光法(IIF)、放射免疫法和酶联免疫吸附测定(ELISA)，若其他方法检测抗dsDNA抗体阳性与临床表现不相符时，建议采用IIF或放射免疫法进行进一步确认[2]。目前，发达国家及中国香港早已开始使用BioPlex 2200全自动免疫分析仪检测自身抗体[3-6]。其检测原理为流式点阵荧光免疫分析技术，在国内的应用还处于初始阶段，只有少数大型医院引进该实验检测技术检测自身抗体。其特点是快捷、准确地为临床危急、重症患者提供早期诊断及评估病情活动度的实验室依据。本研究同时采用BioPlex 2200与ELISA检测抗dsDNA抗体，通过与ELISA的比较，旨在为BioPlex 2200的推广应用提供实验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年3月至2019年1月在深圳市福田区风湿病专科医院住院及门诊确诊的SLE患者49例(SLE组)，其中男性2例，女性47例，年龄17～50岁，平均(30.63±7.68)岁，均符合美国风湿病学会1997年推荐的SLE分类标准。活动期29例，非活动期20例，疾病活动度判断根据2000年修订的SLE疾病活动指数。选取同期非SLE患者52例(非SLE组)，包括32例其他结缔组织病患者(类风湿关节炎15例，未分化结缔组织病8例，干燥综合征6例，混合结缔组织病3例)和20例体检健康者，男性4例，女性48例，年龄18～52岁，平均(31.38±8.48)岁。均排除合并严重心、肝、肾损害及血液、内分泌系统疾病，孕妇、哺乳期妇女、急慢性感染、既往有活动性结核病史及恶性肿瘤患者。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经过深圳市福田区风湿病专科医院伦理委员会批准，并与研究对象签订知情同意书。

1.2仪器与试剂 BioPlex 2200全自动免疫分析仪及配套试剂盒(批号300867)、校准品(批号50597)、质控品(批号50475/50478)均购自美国Bio-Rad公司，该试剂盒可定量检测dsDNA。技术原理是采用多通路磁珠同时检测多种分析物。这些磁珠包被不同种类的荧光染料，每种磁珠包被配基捕获标本中相应的检测物，再通过特殊反应进行检测，目标物被吸附在磁珠表面形成相应免疫复合物而被检测，运用每种染料激发光谱和发射光谱之间的波长差来检测每种分析物和质控磁珠，产生结合物被用作荧光报告基团。系统软件以内标珠固有荧光为标准将信号转换成相对荧光强度值，再将其转换为荧光比率。将荧光率与特定校准曲线来比较，从而得出抗体指数来表示分析物水平。ELISA检测采用抗dsDNA抗体检测试剂盒(购自中国杭州医学实验诊断有限公司，批号E180108CG)，应用酶标仪(购自中国汇松公司，型号MB-580)读取结果。所有试剂均在有效期内使用，并严格按照试剂说明操作。

1.3方法 BioPlex 2200全自动免疫分析仪按照试剂盒操作说明书和仪器BioPlex 2200检测系统要求进行定标和质控后，再进行标本检测。所有研究对象均空腹采集静脉血3 mL，离心后血清标本储存于-80 ℃冰箱。所有血清标本一次性溶解恢复室温后上机检测，水平≥10 IU/mL定义为阳性，线性范围为1～300 IU/mL。ELISA检测按试剂盒操作说明将所有血清标本恢复室温后进行1∶201稀释，并按照操作说明依次加入1～3号标准品、阴性、阳性对照，根据标准品检测值绘制出参数曲线，计算结果，水平>100 IU/mL定义为阳性。

2 结 果

2.1两种方法检测抗dsDNA抗体的性能比较 BioPlex 2200检测抗dsDNA抗体的灵敏度为57.14%(28/49)，特异度为94.23%(49/52)； ELISA检测抗dsDNA抗体的灵敏度为53.06%(26/49)，特异度为96.15%(50/52)。BioPlex 2200检测的阳性预测值低于ELISA，阴性预测值高于ELISA。见表1。

表1 两种方法检测抗dsDNA抗体的性能比较(%)

2.2两种方法检测抗dsDNA抗体的结果一致性分析 两种方法共检测101份血清标本。两种方法检测均为阳性27例，均为阴性69例，不一致5例，两种方法总体符合率为95.05%(96/101)。通过χ2检验评估两种检测方法的差异性，差异无统计学意义(χ2=78.69，P=0.375)；通过Kappa值进行一致性评价，Kappa=0.880，说明两种方法一致性较好。见表2。

表2 两种方法检测抗dsDNA抗体的结果一致性评估(n)

2.3BioPlex 2200检测各组抗dsDNA抗体水平比较 通过单因素方差分析比较各组抗dsDNA抗体水平，BioPlex 2200检测抗dsDNA抗体，3组(SLE组活动期组、SLE非活动期组、非SLE组)抗dsDNA抗体水平比较，差异有统计学意义(F=61.52，P<0.05)。SLE活动期组与SLE非活动期组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SLE活动期组与非SLE组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SLE非活动期组与非SLE组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 BioPlex 2200检测各组抗dsDNA抗体水平的比较

注:与SLE活动期组比较，aP<0.05。

3 讨 论

SLE是一种多系统损害的自身免疫性疾病，好发于育龄女性。常伴有重要器官的受累，如肾脏、肺部、神经系统、血液系统及关节、皮肤等，危重症患者常危及生命，早期诊断和及时治疗对控制疾病发展及预后至关重要。抗dsDNA抗体自1957年就被公认为是SLE的诊断标志物[7]。BARNADO等[8]研究表明，与其他自身抗体相比，抗dsDNA抗体在评估患者主要SLE表现的预后方面可能是最相关的，研究确定抗dsDNA抗体是SLE主要器官受累的驱动因素，对主要器官损害的参与程度最大，抗dsDNA抗体水平对SLE临床表现的影响比自身抗体总体水平更显著。抗dsDNA抗体的检测方法多种多样，国内大多数医院检验科或实验室采用IIF、ELISA、免疫印迹法检测抗dsDNA抗体。其中IIF、ELISA手工操作比较繁琐，一般需要2～3 h才得到结果，人为干扰因素较多且不可避免。免疫印迹法可减少人力资源及外界干扰因素。YI等[9]研究显示，线性免疫印迹抗核抗体17项(ANA-17s)检测结果与欧盟免疫印迹检测结果比较，最常见的抗体几乎完全一致，然而免疫印迹法只有定性结果，传统的检测方法正在被自动化高通量检测方法所取代。

近年来，随着免疫学检测技术的发展，国外已经应用BioPlex 2200全自动免疫分析检测技术检测临床标本[3-7]。BioPlex 2200运用悬浮芯片技术检测多项自身抗体，包括抗dsDNA抗体、抗可溶性抗原(ENA)抗体及抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体等。检测系统完全自动化、智能化、高通量，而且具有很高的分析效率，检测快速、简单、便捷、结果准确、特异度高、灵活性好[7,10]。国外对BioPlex 2200的检测性能方面做了不少对比研究，在检测抗dsDNA抗体方面，BioPlex 2200检测的结果与传统ELISA检测结果具有可比性，可用于临床实验室对自身免疫性疾病的筛查[4]。此外，对水痘带状疱疹病毒、梅毒病毒及人类免疫缺陷病毒急性感染的检测都有较好的性能[11-13]。BOSE等[14]研究显示，BioPlex 2200检测的抗染色质抗体对诊断SLE有较高的特异性，但对区分SLE和混合性结缔组织病或未分化结缔组织病没有帮助。国内除了香港学者AU等[6]使用BioPlex 2200检测抗dsDNA抗体的相关报道外，暂未见其他相关报道。

本研究是同时运用BioPlex 2200和ELISA检测抗dsDNA抗体，研究结果显示，101例研究对象中BioPlex 2200和ELISA有5例检测抗dsDNA抗体结果不一致，其中有4例BioPlex 2200阳性，ELISA阴性，有1例BioPlex 2200阴性，ELISA阳性，通过χ2检验评估两种检测方法的差异性，差异无统计学意义(P>0.05)，即认为两种检测方法的检测效能相同。KIM等[4]研究显示，ELISA检测抗dsDNA抗体阳性的79例标本中，使用BioPlex 2200检测有78例(98.7%)血清抗dsDNA抗体阳性，这两种方法只有1例患者的抗dsDNA抗体检测结果存在差异，一致性好。本研究中ELSIA检测抗dsDNA抗体阳性28例，BioPlex 2200检测阳性31例，与KIM等[4]结果不一致，考虑可能与本研究检测的标本量有关，然而BioPlex 2200通常比其他方法具有更高的灵敏度，但其特异度较低[6]。因此尚需要更大样本量的多中心研究进行进一步的评估。

通过Kappa值进行一致性评价，Kappa值越大，表明一致性越好，若Kappa≥0.750，表明一致性较好，Kappa<0.400，说明一致程度不够理想。本研究结果显示，Kappa=0.880>0.700，说明两种方法一致性较好，证明该检测系统增加了创新性和方便性，而其检测的效能与传统方法不相上下，可以更好地为临床服务。BioPlex 2200检测灵敏度为57.14%，特异度为94.23%，ELISA灵敏度为53.06%，特异度为96.15%，与BIRTANE等[15]报道的抗dsDNA抗体检测在SLE中具有97.4%的特异度和57.3%的灵敏度较相符。ALMEIDA等[16]提出，检测抗dsDNA抗体最有效的方案是同时结合两种定量方法，使结果更加精准。因此临床中需要首先使用方便、快捷的检测方法对抗dsDNA抗体进行初步检测，与临床表现不符时需要用另一种方法再次检测。比较了BioPlex 2200检测抗dsDNA抗体在不同组的水平，除SLE非活动期组与非SLE组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，说明抗dsDNA抗体不仅为SLE的诊断提供重要依据，对临床病情活动的判断亦有重要价值。

BioPlex 2200检测的整体性能与传统ELISA技术相似，但具有检测速度较高和人力资源消耗较少的优点[6]。BioPlex 2200系统具有自动化与智能化的特点，血清直接上机检测，45 min即可得到检测报告，可随时添加标本，支持急诊检测，对急危重症SLE患者的早期诊治具有重大意义。

4 结 论

综上所述，BioPlex 2200全自动免疫分析仪检测抗dsDNA抗体与传统的ELISA相比，检验效能具有较高的一致性，而且其简便、快捷、人工干预少，值得临床上推广应用。