十批产地杜仲丸HPLC指纹图谱的化学成分群分析

2020-05-26

中国医药指南 2020年11期

（枣庄市立医院，山东枣庄 277100）

杜仲为杜仲科植物杜仲的干燥树皮[1]，全国多有栽培。续断为川续断科植物川续断的干燥根[2]。杜仲、续断在处方中常以药对出现，具有补益肝肾，强筋健骨作用，而又独立成方，等量配伍组成杜仲丸。现代药理试验证明杜仲、续断有调节骨密度，抗骨质疏松等作用[1-3]。此外杜仲丸有一定的抗抑郁，抗骨质疏松作用[4-5]。前期工作表明，盐炙与配伍可以影响杜仲丸的药效部位[6]。本研究采用HPLC指纹图谱技术[7-10]，对杜仲丸化学成分群进行分析。

1 仪器与试药

Agilent1100安捷伦，松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、槲皮素、栀子苷对照品购自中国生物制品检验所，续断皂苷Ⅵ由中国药科大学提供、芦丁对照品为实验室自制，纯度分别为98.5%。乙腈为色谱纯。杜仲、续断经山东中医药大学周凤琴教授鉴定[6]。杜仲：洗净，去栓皮，切丝0.5 cm。续断：净制，切段。见表1。

表1 杜仲、续断组合表

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱为phenomenex Cl8（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为25 ℃，流动相为乙腈0.1%磷酸水溶液（梯度洗脱，0～60 min，乙腈从6%线性梯度至36%），流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm，分析时间：70 min，进样量：20 μL。

2.2 供试样品的制备：称取杜仲饮片剪成3 mm以下碎片，续断粉碎，过2号筛，粉末等量混合，称取2.00 g，置于250 mL烧瓶中，量取60%乙醇100 mL，浸泡1 h，回流3 h，双层滤纸抽滤，于60 ℃减压回收至无醇味，用石油醚萃取，至石油醚层无色，定容，过滤，取续滤液作为杜仲丸供试品溶液[11]。

2.3 对照品溶液的制备：称取松脂醇二葡萄糖苷4.18 mg[12]，续断皂苷Ⅵ5.03 mg[13-14]，绿原酸5.65 mg，芦丁10.92 mg[15]，槲皮素3.89 mg[16]，栀子苷6.96 mg等对照品，分别置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，过滤。并各取适量溶液，混匀，作为对照品混合溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验：取杜仲丸供试品溶液20 μL，按照“2.1”项所述色谱条件，连续进样6次。结果11个共有峰的保留时间RSD值＜0.5%，峰面积比值RSD值＜5%。提示精密度良好。

2.4.2 稳定性试验：取杜仲丸供试品溶液20 μL，按照“2.1”项所述色谱条件，在0、2、4、8、16、24 h依次进样。结果11个共有峰的保留时间RSD值＜0.5%，峰面积比值的RSD值＜5%。提示24 h内杜仲丸供试液稳定性良好。

2.4.3 重复性试验：取杜仲丸样品6份，平行制备杜仲丸供试品溶液20 μL，按照“2.1”项所述色谱条件进样，结果11个共有峰的保留时间RSD＜0.5%，峰面积比值的RSD值＜5%。提示重复性较好。

2.5 样品的测定：精密吸取杜仲丸供试液和对照品溶液各20 μL，按上述色谱条件进样分析。

2.6 指纹图谱的建立与分析

2.6.1 共有峰的标定：10批杜仲丸供试品溶液指纹图谱有11个共有峰。松脂醇二葡萄糖苷、续断皂苷Ⅵ、绿原酸、芦丁、栀子苷、槲皮素7种标准品溶液与杜仲丸供试品溶液药材的HPLC指纹图谱对比分析，在相同色谱条件下只有松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、皂苷续断Ⅵ的保留时间与指纹图谱中相应峰一致，且两个峰的紫外吸收曲线是相同。选取6号峰为参照峰，其中杜仲丸的高效液相指纹图谱相对保留时间稳定，但相对峰面积差异较大，1号峰RSD为1.06，2号峰RSD为1.03，4号峰RSD为1.19，8号峰RSD为1.23、11号峰RSD为1.15。结果见图1、2，表2、3。

图1 杜仲丸供试品高效液相指纹图谱

图2 对照品高效液相色谱

表2 杜仲丸供试品特征峰和对照品的保留时间

2.6.2 相似度评价：分别将10批杜仲丸供试品溶液所得数据导入中药色谱指纹相似度评价系统（2004A版），以中位数为参数生成杜仲丸

3 讨论

3.1 从指纹图谱共有模式比较结果分析，十批杜仲丸供试品溶液都有11个特征峰，且不同产地相同工艺的杜仲丸的高效液相指纹图谱相对保留时间稳定，但峰面积差异较大，可能由于产地、气候、生长环境、生长年份造成的差异所致。其中对化学成分1号峰、2号峰、4号峰、8号峰、11号峰的含量影响较大。

3.2 杜仲生产于湖北、四川、贵州、云南等省，从指纹图谱上看在指纹图谱的共有模式。10批杜仲丸指纹谱图的重叠图见图3，共有模式见图4，计算各批杜仲丸供试品溶液的相似度，样品1、2、4、7、9、10相似度高于0.8，样品5、6相似度在0.5左右。样品1、2、4、7、9、10的杜仲来自于云南、贵州、四川。而样品5、6的杜仲来自于陕西。提示杜仲产区有一定的地域性，且同一地域的杜仲差异性小。结果见表4。这几个地区的杜仲的化学成分群含量较高，而产于陕西的杜仲的化学成分含量较低，表明杜仲产区有一定的地域性。此外本实验为进一步分析盐炙和配伍对杜仲丸化学成分群的影响提供方法学研究。