基于GC-MS-O香气成分分析和多元统计分析的柚子品种鉴别

高 歌 庞雪莉 刘海华 邹 辉 廖小军*

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 农业部果蔬加工重点实验室国家果蔬加工工程技术研究中心 北京100083 2 北京物资学院 北京市物流系统与技术重点实验室 北京101149 3 中国农业科学院烟草研究所 山东青岛266001）

柑橘类饮料以其优美的色泽、丰富的营养、芳香的口味吸引着广大消费者，在全球广受推崇，购买量也是最大的。在整个果汁市场中，2/3 都是这类产品，按照原料的区别，一般又可以细分成：橙汁、柚汁、柑汁等多种类型[1]。我国种植柚子树历史悠久，产地分散，品种繁多，开展柚子品种鉴别研究具有重要的意义。柚子汁是一个复杂体系，其组成既包括挥发性化合物（如醇类、醛类、酮类、酯类等），也包括非挥发性化合物（如有机酸和糖等）[2]。这些挥发性化合物虽然只有痕量级别的含量，但是它们的存在构成了必不可少的特征香气[3-4]。香气是影响食品特性的重要因素，与食欲、营养密切相关。不同品种的水果的香气成分不同，香气成分能够客观地反映不同水果品种的风味特点，是评价果实风味品质的重要指标[5]。

目前，研究挥发性物质的技术主要以气相色谱质谱连用（GC-MS）、电喷雾质谱（ESI-MS）、三重四级杆质谱（LC-QQQ-MS/MS）等为代表的质谱技术，高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、薄层色谱（TLC）等为代表的色谱技术，以及傅里叶红外光谱（FT-IR）、二维红外光谱（2D）、紫外分光光谱（UV）等为代表的光谱技术[6]。作为一种成熟的检测方法，GC-MS 以其样品量小、检测限低、灵敏度高的优点广泛应用于蜂蜜、茶叶、水果、酒类等挥发性物质的鉴定[7]。PCA 是一种通过数据压缩对多维数据进行降维的多元统计分析方法，它的优势在于操作简单，没有参数限制，应用范围较广，常被用于人脸识别、图像压缩、特征提取等领域[8]。PLS-DA 是在PCA 的基础上，多因变量对多自变量的回归建模方法，在产品质量预报、毒物分析、食品分析、环境化学等方面有着广泛的应用[9]。目前，结合GC-MS 分析和多元统计分析对我国柚子品种品质，特别是挥发性物质特性的研究尚为空白。本文利用GC-MS-O 结合PCA 和PLS-DA 多元统计方法对我国5 个柚子品种的挥发性成分和香气贡献组分进行分析，研究其成分、品种、味道间的相互关系。

1 材料和方法

1.1 材料

柚子原料：采摘区间是2015年11月份至2016年1月份。5 个品种分别为处红柚（浙江丽水）、胡柚（浙江常山）、强德勒（江西赣州）、西柚（江西赣州）和黄金柚（福建平和）。

化学试剂：高纯氦气、正构烷烃标准品（C8-C20）。

1.2 仪器

SPME 手动进样器（DVB/CAR/PDMS 萃取头），美国Supelco 公司；气相色谱-质谱联用仪（7890A-5975C 型），美国安捷伦公司；DB-5 毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），美国安捷伦公司；pH 计（STARTER 2100/3C 型），美国奥豪斯公司；阿贝折射仪（AR2008 型），德国Kruess 公司；自动电位滴定仪（842 型），瑞士万通公司；色差仪（Color Quest），美国Hunterlab 公司；高效液相色谱仪（LC-20A 型），日本岛津公司；糖柱（Asahipak NH2P-50 4E），美国Water 公司；紫外分光光度计（UV-762），上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 对采摘后的新鲜柚子进行榨汁，倒入60 mL EVOH 瓶中，通过液氮进行冷冻处理，-80 ℃储藏。

1.3.2 理化指标分析 25 ℃室温下，用pH 值为6.86 和4.01 的标准缓冲液对pH 计进行较正，测定样品的pH 值。可溶性固形物的测定用数字阿贝折光仪，测前仪器先用蒸馏水调零，测定时将2滴样品滴于棱镜上，选择温度校正模式测定（25℃）。糖酸比为总可溶固形物与总酸的比值。

1）色泽的测定 对全自动色差仪用光阱和白板调零后，取20 mL 摇匀的柚子汁置于比色杯中，在反射模式下测定L、a、b 值。L 为明度指数，反映样品的亮度，±a 反映样品的红值和绿值，±b反映样品的黄值和蓝值，ΔE 为两点之间的变化值[10]。

2）总酸的测定 采用电位滴定法测定。量筒量取40 mL 柚子汁于150 mL 小烧杯中，用自动电位滴定仪，0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定，直至终点pH 8.1。可滴定酸按公式2 计算。

式中：TA——可滴定酸含量；V0——柚子汁样品总体积；V2——消耗的NaOH 标准液体积；C——NaOH 标准液的浓度；m——样品质量；V1——滴定所用样品体积；K——折算系数，以柠檬酸计，0.070。

3）总酚的测定 采用 Folin-ciocalteu 法测定，参考Singleton 等[11]的方法并略作修改。样品用超纯水按体积比1∶1 稀释5 倍。Folin-ciocalteu 试剂用超纯水按体积比1∶9 稀释10 倍。取稀释后的柚子汁0.5 mL，取0.5 mL 稀释后的柚子汁与2 mL 稀释的Folin-ciocalteu 试剂混合，加入1.8 mL 7.5% Na2CO3溶液，静置1 h，用紫外分光光度计测定波长765 nm 处的吸光值。制作没食子酸标准曲线，以每mL 样品含有相当于mg 没食子酸来表示总酚含量，单位为mg GAE/mL。

4）糖的测定 采用HPLC 法，将50 mL 柚子汁于50 ℃水浴加热30 min，12 000 r/min 离心15 min，取上清液过0.45 μm 过滤器，待测。采用Waters-HPLC 系统，Asahipak NH2P-50 4E（规格4.6 mm×250 mm，粒径5 μm）色谱柱，RI-2301 示差检测器，流动相为50 mg/L EDTA 钙盐溶液，等速洗脱，进样量20 μL，流速0.5 mL/min，温度90℃。

1.3.3 挥发性组分的提取 参考Liu 等[12]方法，采用顶空固相微萃取（SPME）方法提取。准确量取30 mL 柚子汁于60 mL 萃取瓶内，搅拌转子，保持40 ℃水浴，平衡10 min 后，将固相微萃取针插进，推出萃取纤维头吸附萃取30 min。随后，立刻插入进样口，于250 ℃解吸附5 min 进行GC-MS 数据采集。

1.3.4 GC-MS-O 分析 参考Pang 等[13]方法进行挥发性成分的检测。毛细管柱为DB-5 柱（30 m×250 μm×0.25 μm，美国安捷伦），高纯N2为载气，恒定流速1.0 mL/min，分流比1∶50。柱升温程序：起始温度40 ℃，维持3 min，以2 ℃/min 速度将其提高至140 ℃，维持2 min，以20 ℃/min 速度将其提高至250 ℃，保持6 min。质谱条件：通过全扫描模式开展相应的信号采集工作，轰击能量70 eV；扫描质量范围39～450 amu，扫描频率1/s。采用Cheng 等[14]方法检测香气活性成分，用嗅辨仪完成这一步，样品准备、GC 条件与GC-MS 相同，其中，传输线的温度保持在240 ℃。分析其末端的香气组分并鉴定。这期间，评价人员登记全部香气物质存在的时间点，同时对具体属性做出分析，每个样品评价2 次。最后以每一种物质被嗅闻到的总数即检测频率（DF）来表征每种物质香气贡献大小。将DF 大于或等于2 的物质定义为柚子汁的特征香气成分。

1.3.5 定性、定量分析 利用检索NIST11 标准谱库，参照参考文献[13]中线性保留指数以及香气属性对挥发性化合物进行定性研究。各种化学组分用峰面积归一化法进行定量。

1.3.6 数据统计分析 利用软件SPSS 17.0 进行单因素方差分析，P＜0.05（n=3）。利用软件SIMCA进行PCA 和PLS-DA 分析。

2 结果与分析

2.1 理化指标

果汁的香气特征，不仅受挥发性成分的影响，也受非挥发性成分的组成和含量的影响[15]。表1列出5 个柚子品种的主要理化性质，其中，处红柚和强德勒柚果肉呈红色，其它3 个品种果肉呈现不同的黄色，这与L*，a*，b*值（见表1）的一致。柚子品种间的总酸、pH、糖酸比以及颜色差异较大，其中，强德勒柚总酸含量最低（0.48）、pH 值（4.61）最高，而处红柚总酸含量最高（0.82）、pH 值最低（3.73）。强德勒柚糖酸比（18.18）最高，其次是黄金柚（14.3）、胡柚（9.65）、西柚（9.33）和处红柚（7.74）。处红柚总酚含量最高（19.52 mg GAE/100 g FW），其次是强德勒柚（18.5 mg GAE/100 g FW）、再其次是胡柚（17.18 mg GAE/100 g FW），而黄金柚（15.78 mg GAE/100 g FW）和西柚（15.58 mg GAE/100 g FW）最低。可见，5 个品种柚子的可溶性固形物、总糖及单糖含量之间差异不显著。

表1 我国柚子品种的产地及主要理化指标Table1 The origins and physiochemical properties of different pomelo varieties from China

2.2 挥发性成分构成

5 种柚子样品中，测定的挥发性成分总和通过图1分析，这些种类的挥发性成分非常多，如：萜烯类、醇类、酚类、酮类、酯类等。经定量分析，具有挥发性的主要成分是萜烯类物质，其峰面积百分比是：处红柚82.54%、西柚78.58%、强德勒柚60.58%、胡柚10.28%、黄金柚9.33%。其次，醇类也较多，其中，黄金柚（33.68%）、胡柚（32.02%）中醇类含量更加突出，西柚（4.67%）、处柚（4.39%）中醇类含量较少，而强德勒柚中未检出醇类。醛类、酯类、酮类也存在于各种的柚子中。

5 种柚子样品中鉴定出所有挥发性物质，按照类别和保留时间的先、后顺序列于表2。5 个品种的柚子，有香气贡献的成分57 种，其中，处红柚含32 种，胡柚含23 种，强德勒柚含24 种，西柚含32 种，黄金柚含24 种。柠檬烯、大根香叶烯、γ-摩勒烯、壬醛和癸醛为5 种柚子的共有组分，其含量有差异。桧烯、紫苏烯、α-愈创木烯、（Z）-柠檬醛、（E）-芳樟醇仅在处红柚中发现，（E）-2-庚烯醛、3-辛酮仅存在于胡柚中，β-榄香烯和对乙烯基愈疮木酚仅存在于强德勒柚中，γ-芹子烯和枯醇仅存在于西柚中，α-紫罗酮、（E）-香叶基丙酮、β-紫罗酮仅存在于黄金柚中。柠檬烯是强德勒柚、西柚、胡柚和处红柚中较突出的香气成分，其相对峰面积分别占33.47%（强德勒柚）、21.64%（西柚）、9.7%（胡柚）和7.9%（处红柚）。黄金柚中突出的香气成分是己醇和己醛，相对峰面积百分比占28.48%和5.82%。

2.3 特征香气组分分析

挥发性成分含量的高低并不代表实际感官阈值的高低，通过GC/MS-O 嗅闻频率检测辨识挥发性成分。据表3所示，通过嗅觉感受的柚子香气活性成分38 种，其香气属性有：香脂味、松香味、柑橘味、木香味、青草味、花香、薄荷味。

图1 不同柚子品种中挥发性成分含量（%）Fig.1 The relative content（%）of volatile components in different pomelo varieties

这些品种的柚子里都存在香脂味物质，这是人们经常可以闻到的重要味道来源。对于柚子，松香味同样是其较突出的香气属性，在强德勒柚和西柚里，β-蒎烯的作用比较突出，是松香味的重要来源，而萜品油烯是处红柚、胡柚和西柚中贡献该属性的重要物质。柚子里最重要的香气属性就是人们闻到的柑橘味，它是来自柠檬烯、壬醛、癸醛。其它贡献柑橘味有β-荜澄茄油萜，存在于很多品种的柚子中，而黄金柚没有这种味道。在处红柚、西柚、黄金柚中普遍存在诺卡酮。贡献木香味的重要来源是大根香叶烯，存在于5 个品种的柚子中。在处红柚、强德勒柚、西柚中普遍存在δ-榄香烯、香橙烯和γ-杜松烯，呈木香味。青草味来自γ-摩勒烯、β-氧化石竹烯、己醛、己醇、1-庚醇、壬醇、（E）-香叶基丙酮。在处柚、强德勒柚、西柚、黄金柚中都有薄荷味，这是因为其中还有β-环化枸橼醛。处红柚中有较清淡的花香，是因为其中存在（E）-芳樟醇，而强德勒柚有丁香味，是因为其中存在乙烯基愈疮木酚。在黄金柚中有紫罗兰的味道，是因为其中有β-紫罗酮。

2.4 PCA 分析

这是重要的多元线性分析方法，PCA 是通过数据降维的原理，主要研究物质及其相应的变量情况，与各个品种的潜在关系[16]。分析表明，这些品种的柚子的挥发性成分是不同的。PCA 法可以较好地区分不同的柚子品种。如图2a 所示，PC1、PC2 和PC3 作为前3 个主成分，其方差贡献率分别为40.5%，25.2%和18.6%，累计贡献率达到84.4%，能较好地代表原始数据所反映的信息。

载荷图主要提供香气贡献组分与样品间的相关性。如图2b 所示，处红柚区分于其它品种的主要成分为大根香叶烯、β-荜澄茄油萜、杜松萜烯、γ-摩勒烯等，产生胡柚独特香气的主要成分为1-庚醇、3-辛酮、聚伞花素等，强德勒柚香气特征主要的贡献物为β-榄香烯、瓦伦烯、苯乙烯和对乙烯基愈疮木酚等，西柚的主要香气贡献物为异丁香烯、α-石竹烯、菖蒲烯、甲基庚烯酮等，而黄金柚和壬醛、癸醛、己醇、辛醇、2-正戊基呋喃这些化合物高度相关联。

c/%量含对相柚金黄柚西柚勒德强nd nd nd 2.4±0.35 0.92±0.07 0.41±0.11 1.33±0.52 0.52±0.04 0.21±0.05 0.9±0.11 0.04±0.01 0.06±0.02 0.54±0.09 nd nd nd nd nd 28.48±3.97 3.36±0.15 nd 2.50±0.04 0.08±0.02 nd 1.46±0.07 nd nd nd nd nd nd 0.06±0.01 nd 0.72±0.08 nd nd nd nd 0.05±0.01 nd nd nd nd 7.58±0.01 1.77±0.54 0.1±0.01 nd nd 0.32±0.01 nd nd 0.71±0.02 nd nd 0.12±0.06 1.29±0.04 nd 0.29±0.07 nd nd 0.34±0.04 nd nd 0.65±0.12 0.72±0.02 5.95±1.92 nd 0.12±0.03 nd 2.78±0.52 nd nd。差准：标 c SD。：//www.flavournet.org http站网于源述描味柚胡d柚红处0.35±0.03 nd 1.94±0.11 0.19±0.01 0.66±0.05 0.16±0.03 nd 0.04±0 nd nd nd 0.05±0.01 15.25±2.12 3.33±0.71 14.79±0.85 nd 1.27±0.66 nd nd 0.23±0.01 nd nd 0.38±0.03 nd nd nd 1.55±0.08 nd nd 3.51±0.51 nd nd nd nd nd nd nd 0.31±0.08 nd 0.02±0 nd 0.44±0.09 nd nd 0.89±0.04 nd 2.09±0.1 nd，气气香有中库：谱；AD数指留保的较比献文称名质物法方定鉴b数指留保醛烯庚）-2-（E，AD，RI MS 951醛壬MS，RI，AD 1 105醛癸，AD，RI MS 1 210醛橼枸化β-环MS，RI，AD 1 224醛糠基甲羟5-，AD，RI MS 1 236醛檬（Z）-柠MS，RI，AD 1 276醇己MS，RI，AD 871醇庚1-，AD，RI MS 965醇辛MS，RI，AD 1 069醇樟芳）-（E，AD，RI MS 1 071醇枯MS，RI，AD 1 101醇壬，AD，RI MS 1 175酚木疮愈基烯乙对，AD，RI MS 1 317酮辛3-，AD，RI MS 981酮烯庚基甲MS，RI，AD 983酮罗紫α-，AD，RI MS 1 423酮丙基叶（E）-香MS，RI，AD 1 446酮罗紫β-，AD，RI MS 1 468酮卡诺MS，RI，AD 1 543酯乙酸己MS，RI，AD 997酯乙酸辛，AD，RI MS 1 203烯乙苯，AD，RI MS 890素花伞聚MS，RI，AD 1 019喃呋基戊2-正MS，RI，AD 986：与；RI较比谱质行进 库Wiley 和NIST用，使：MS法方定 b 鉴。a号）2表（续号编类种B3 29 B4 30 B5 31 B6 32 B7 33 B8 34 C1类 35醇C2 36 C3 37 C4 38 C5 39 C6 40 D1类 41酚E1类 42酮E2 43 E3 44 E4 45 E5 46 E6 47 F1类 48酯F2 49烃香芳G1 50 G2 51 H1它 52其编别类分成性发a 挥：注。出检：未d nd

表3 不同柚子品种中香气贡献组分的嗅闻频率检测分析Table3 The detection frequency of aroma-active components in different pomelo varietes

图2 PCA 得分图（a）和载荷图（b）Fig.2 The score figure（a）and loading figure（b）of PCA

2.5 PLS-DA 分析

柚子香气特征是不同香气属性的全面展示，柑橘味、花香味等各种香气属性都有过报道[17]。要想获知国内各种类型的柚子品种的香气特征差异，通过PLS-DA 可以进行各品种柚子与相应的香气属性的关联研究[18]，图3是5 个品种与香气属性的PLS-DA 双标图。由此看到，不同品种的柚子的香气也有比较大的区别。在图4中，利用最小二乘判别研究获得了相应的VIP 值，当该数值超过1 的情况下，将它看作能够分辨各品种柚子的香气属性。作者发现可以区分5 种柚子的味道，分别是：青草味、花香味、薄荷味、松香味。本结果为相应的挥发性物质及感官特性的研究提供重要线索。

3 结论

图3 PLS-DA 双标图Fig.3 The biplot figure of PLS-DA

图4 不同香气属性的VIP 值图Fig.4 The VIP value of different aroma properties

本研究对我国不同地理来源的5 种柚子的挥发性成分进行评价和表征，GC-MS 数据显示柚子中挥发性组分种类构成丰富，5 个品种柚子之间挥发性物质和含量均有差异，主要包括萜烯类、醛类、醇类、酮类、酯类等。嗅闻结果是得到不同柚子品种的主要香气贡献组分，呈现柑橘味、松香味、香脂味、青草味、木香味等主要香气属性。PCA 分析能很好地区分不同来源柚子品种，并鉴定出其特征指纹组分；而PLS-DA 分析表明青草味、花香味、薄荷味和松香味作为区分不同品种柚子的主要特征风味。研究表明，基于挥发性成分差异的GC-MS-O 分析结合多元统计分析识别不同柚子品种是可行的。本研究对我国5 种柚子的风味特征进行研究，为其品质控制和鉴定提供理论依据。