热辅助超声波处理中VBNC态鼠伤寒沙门氏菌产生及其机制

张蕊蕊 聂新颖 廖红梅 刘元法

（江南大学食品学院 无锡214122）

热辅助超声波（thermosonication，TS）是在超声波的基础上结合中等强度热处理，以达到食品杀菌、灭酶和保持品质的一种加工方式。有研究表明TS 具有良好的杀菌效果[1-4]。例如，Lee 等[5]使用TS 处理磷酸缓冲液中的大肠杆菌，发现在61 ℃下TS 处理2 min，可使活菌数减少2 log10（CFU/mL）。Abid 等[6]报道在60 ℃下TS 处理10 min 使苹果汁达到商业无菌。作者在前期研究中采用TS 处理牛肉膏蛋白胨酵母提取物（Beef Peptone Yeast，BPY）培养基中鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）时发现能够达到降低近8 个对数的杀菌效果[7]。在一些条件下，作者也检测到鼠伤寒沙门氏菌的活菌数与可培养数之间有较大的差距，进而提出在这些条件下部分鼠伤寒沙门氏菌转入一种特殊的休眠状态，即活的非可培养（viable but non-culturable，VBNC）状态。例如，在TS 处理（380 W、53 ℃、30 min）条件下，有2.84 lg（CFU/mL）鼠伤寒沙门氏菌以VBNC 态存活。这表明单以传统的固体培养基平板计数来评价TS 的杀菌效果可能造成漏检的风险。

VBNC 态是微生物尤其是非芽孢杆菌在不适宜环境下产生的一种特殊休眠状态[8]，其在适当条件下可能复苏的特性对食品质量安全及消费者健康有潜在威胁。有研究表明鼠伤寒沙门氏菌在寡营养[9]、紫外[10]、过氧化氢[11]、高盐高渗[12]、氯消毒剂[13]等条件下进入VBNC 态以达到存活目的，然而鲜有报道在TS 处理中进入VBNC 态。大量研究表明TS 技术杀菌过程中主要是基于超声波和热处理中机械作用、化学作用和加热对微生物细胞膜、核酸和蛋白质等的破坏作用而达到杀菌目的，对于其如何诱导细菌进入VBNC 状态并无报道。作者在前期研究中发现自由基清除剂对于鼠伤寒沙门氏菌活性具有显著影响[14]，推测TS 处理中产生的自由基可能对于VBNC 态的产生具有推动作用，因此有必要定性、定量研究自由基对VBNC 态产生的影响。

本文主要研究TS 处理条件对BPY 培养基中鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC 态的影响，分析TS 处理过程中自由基产生与VBNC 态发生率指数之间的关系，以期为TS 技术应用于食品杀菌提供更好的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 蛋白胨、牛肉膏，北京奥博星生物科技有限公司；酵母粉、氯化钠、葡萄糖、琼脂粉，国药集团上海化学试剂有限公司；细菌DNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；细菌RNA提取试剂盒，杭州博日公司；RT-qPCR 试剂盒、反转录试剂盒、EASY Dilution，日本Takara 公司；qPCR 试剂盒，德国Qiagen 公司；DMPO，美国Sigma Aldrich 公司。

1.1.2 仪器与设备 7900HT 荧光定量PCR 仪，美国应用生物系统公司；EMX plus-10/12 电子自旋共振波谱仪，德国布鲁克科技有限公司；SCIENTZ-ⅡD 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；DC-0506 低温恒温槽，上海衡平仪器仪表厂；TGL-16M 冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；SPX-250B-Z 生化培养箱，上海博讯医疗设备厂；LDZX-30KBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2D 超净工作台，苏州净化设备有限公司。

1.1.3 菌株 鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115（Salmonella enterica serovar Typhimurium）由中国医学细菌菌种保菌管理中心提供。

1.1.4 培养基 BPY 培养基（g/L）：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、氯化钠5 g 和葡萄糖5 g，用NaOH 调节pH 值为7.0，121 ℃灭菌15 min，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液准备 将-80 ℃冻存的鼠伤寒沙门氏菌菌株取出，在SS 琼脂平板上划线37 ℃培养24 h，挑取单菌落于100 mL BPY 液体培养基37 ℃培养10 h，制成初始含量为107（CFU/mL）的菌悬液作为工作菌液。

1.2.2 TS 处理 将夹套烧杯用75%酒精浸泡15 min，用无菌水冲洗3 遍，再用待测菌液润洗1 遍，加入5 mL 菌液，并加入DMPO 至终浓度100 mmol/L。打开水浴循环，温度达到设定温度时开启超声设备，待处理完成后立即关闭水浴循环，并立即取样进行DNA、RNA 的提取及可培养数的测定，同时进行ESR 检测。

1.2.3 鼠伤寒沙门氏菌的定量检测

1.2.3.1 DNA、RNA 提取及反转录 取1 mL 经TS 处理的菌液于4 ℃、12 000 r/min 离心2 min，收集菌体，采用细菌DNA 提取试剂盒提取DNA，得到50 μL DNA 样品。采用细菌RNA 提取试剂盒提取RNA，得到50 μL RNA 样品。为排除DNA干扰，用反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）去除基因组DNA，将RNA反转录获得cDNA 样品。

1.2.3.2 总菌数、活菌数及可培养数检测

1）总菌数的检测方法 参照Jiang 等[15]和Liao 等[14]的方法进行qPCR检测。将DNA 用EASY Dilution 试剂（for Real Time PCR，日本Takara 公司）进行10 倍梯度稀释，稀释7 个梯度100～10-6，建立qPCR 得到的荧光阈值（CT）与平板计数法得到的菌落数[log10（CFU/mL）]之间的标准曲线。总菌数即CT值在qPCR 标准曲线上相对应的菌落数。

2）活菌数的检测方法 参照Jiang 等[15]和Liao 等[14]的研究方法进行RT-qPCR。将cDNA 用EASY Dilution 试剂进行10 倍梯度稀释，稀释6个梯度100～10-5，建立RT-qPCR 得到的荧光阈值（CT）与平板计数法得到的菌落数[log10（CFU/mL）]之间的标准曲线。活菌数即CT值在RT-qPCR 标准曲线上相对应的菌落数。

3）可培养数的检测方法 参照国标GB4789.2-2010 方法，采用平板计数方法测定样品的可培养数。

1.2.3.3 VBNC 数及VBNC 态发生率指数的计算

VBNC 数是活菌数与可培养数之间的差值。VBNC 态发生率指数的计算公式：

1.2.4 自由基定量检测 将毛细管封闭的一端折断，吸入待测样品高度1.5 cm。用凡士林封住远离样品端，样品端朝下置于核磁管中，立即将核磁管置于共振腔，并使样品位于共振腔中部。ESR 检测的参数设定为：中心磁场3 350 G、扫场宽度150 G、扫描时间20.01 s、扫描次数10、微波功率20 mW。数据使用Bruker Xenon 软件分析，以碳为中心自由基的第1 条谱线的峰高代表自由基强度。每组重复样品做3 次平行检测。

1.2.5 自由基与VBNC 态形成之间的关系验证为了验证TS 处理过程中自由基的产生量与VBNC 态发生率指数之间的相关性，使用自由基清除剂丙酮酸钠进行验证。在TS 处理之前加入丙酮酸钠，经380 W、53 ℃、6 min 处理后立即测定自由基及VBNC 态发生率指数。所有试验经3 组重复。

1.2.6 数据处理 采用Origin 8.5 软件作图，SPSS 17.0 进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 TS 处理对BPY 中鼠伤寒沙门氏菌 VBNC态产生的影响

如图1所示，当功率达到190 W 及以上，活菌数与可培养数随功率的增加而显著下降，且二者的间距变大，表明TS 处理后部分细菌进入VBNC态。在功率570 W 时，存活鼠伤寒沙门氏菌全部进入VBNC 态（图1a）。在32～42 ℃之间，活菌数与可培养数的变化不大；当处理温度高于42 ℃，活菌数与可培养数急剧下降，且二者的间距逐渐增大，说明VBNC 态数量增加。当温度57 ℃时，VBNC态达到最大值3.61 log10（CFU/mL）（图1b）。在380 W、53 ℃条件下处理2 min 后，活菌数保持在1.55 log10（CFU/mL），然而可培养数显著下降直至低于检测限（8～10 min），10 min 时进入VBNC 态4.27 log10（CFU/mL）。以上结果表明，TS 处理能有效杀灭BPY 中大部分鼠伤寒沙门氏菌，其灭菌率高达99.99%，然而仍有少量鼠伤寒沙门氏菌在TS 处理中迫于外界压力进入VBNC 态以存活。TS 处理强度与微生物失活率呈正相关，这与Anaya-Esparza等[2]的研究结果相近。以上结果表明鼠伤寒沙门氏菌产生VBNC 态与TS 处理条件有关。

2.2 TS 处理过程中自由基产生及分析

如图2所示，未经TS 处理的BPY 具有极低ESR 光谱信号，而经TS 处理（380 W、53 ℃、6 min）后，BPY 的ESR 光谱信号显著增强且变得复杂。主要产生3 种自由基信号，包括以碳为中心的自由基（DMPO-·R：g 因子=2.00654；αN=15.4727 G；αH=22.8898 G）、羟基自由基（DMPO-·OH：g 因子=2.0065；αN=αH=14.8 G）与氢质子自由基（DMPO-·H：g 因子=2.0066；αN=15.87 G；αH=22.5 G），其中最主要的是以碳为中心的自由基。羟基自由基和氢质子自由基主要是因超声波作用在水分子上而产生。同时羟基自由基为已知较强的氧化剂，能氧化BPY 中的有机物质而产生以碳为中心的自由基，这种可能已被证实[16]。另一种可能是BPY中有机物质在TS 的热与空穴作用下发生C-H 键的断裂，生成以碳为中心的自由基。具体过程因BPY 体系复杂而难以推测，需进一步验证。

图1 TS 处理对鼠伤寒沙门氏菌总菌数、活菌数、可培养数的影响（CK 组为未处理样品）Fig.1 Variations in total，viable and cultutable counts of S.Typhimurium during TS processing（CK：untreated sample）

2.3 TS 处理中自由基强度与VBNC 态发生率的关系解析

图2 TS 处理过程中产生的自由基ESR 检测谱图Fig.2 ESR spectra of DMPO solution，untreated BPY and TS treated S.Typhimurium suspension in BPY，and fitting curves of 3 kinds of free radicals trapped by DMPO

图3a 结果显示，随着功率的增加，自由基强度与VBNC 态发生率指数均呈增加趋势。图3b 结果显示，在32～52 ℃之间，随着温度升高，自由基强度呈上升趋势，且VBNC 态发生率指数呈上升趋势；52 ℃后，自由基强度呈下降趋势，此时VBNC 态发生率指数达到最大值1 000。图3c 表明，随着时间延长至8 min，自由基强度与VBNC 态发生率指数均呈上升趋势；在8 min 后，VBNC 态发生率指数仍保持上升的趋势，自由基强度呈明显的下降趋势。在TS 处理强度较弱时，自由基产生并积累，其中羟基自由基可能与BPY 中有机物质进一步反应生成以碳为中心的自由基，使其强度增加；当累积到最高水平后，羟基自由基和以碳为中心自由基不再持续积累。一方面由于功率和温度升高或处理时间延长使溶液蒸气压持续升高，造成空穴气泡过早断裂，进而其瞬间高温与高压发生几率下降，自由基强度降低；另一方面，DMPO与碳为中心自由基的加合物随着TS 功率和温度升高或处理时间延长会发生热分解[17]。

图3 TS 处理条件对BPY 体系中产生自由基强度及鼠伤寒沙门氏菌VBNC 态发生率指数间的关系Fig.3 Effects of TS processing on generation of free radicals and their corresponding VBNC state incidence index

TS 处理过程中产生的自由基强度与VBNC态发生率指数之间关系呈现“S 型”曲线，可分为3个阶段：起始期、快速增长期与稳定期。所得试验数据均匀分布在Boltzmann 模型曲线两侧，说明该模型能较好地拟合试验数据（图4）。自由基强度与VBNC 态发生率指数之间具有良好的相关性，当自由基强度小于0.02，自由基对VBNC 态发生率指数影响较小。随着自由基强度的增加，VBNC态发生率指数显著增加，说明自由基是VBNC 态产生的关键因素。当自由基强度大于0.10，虽然其强度增加，但是VBNC 态发生率指数保持在最大值1000，主要是由于此时残存细菌全部进入VBNC 态，说明自由基是诱导鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC 态的关键因素。

为了验证模型的适用性，重新设计1 组试验，所得数据均匀分布在该曲线上及两侧（图5）。对VBNC 态发生率指数实测值与模型预测值进行比较（图5），发现两组数据均匀分布在y = 65.25 +0.93x 线上及两侧，表明模型适用性较好。进而采用Af、Bf、SS 与R2来评价拟合曲线的拟合度。其中，Af、Bf 越接近1，拟合度越高；SS 越小，拟合曲线的精确度越高；R2越大，曲线的拟合度越高[18-19]。得到结果：R2= 0.94，Af = 1.10，Bf = 1.38，SS =13.40。拟合曲线的拟合度良好，准确度较高，Boltzmann 模型可用于评价和预测TS 处理BPY中自由基产生与鼠伤寒沙门氏菌VBNC 态发生率指数间的结果和趋势。

图4 TS 处理过程中产生自由基强度与VBNC 态发生率指数之间相关性的拟合Fig.4 Correlation between the intensity of free radicals and VBNC state incidence index in S.Typhimurium

图5 TS 处理过程中实测与模型预测VBNC 态发生率指数之间的关系Fig.5 Correlation between the experimental data and the predicted data obtained with the Boltzmann model

2.4 自由基对VBNC 态产生的影响验证

为了进一步验证自由基对鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC 态的影响，在TS 处理前加入适量自由基清除剂，即0～200 mmol/L 丙酮酸钠。如图6所示，当丙酮酸钠浓度为0～20 mmol/L 时，鼠伤寒沙门氏菌的活菌数与可培养数随其浓度的增加而快速增长，且二者之间的距离逐渐缩小，表明VBNC 态数量呈下降趋势。与此同时，自由基强度也呈下降趋势，表明丙酮酸钠能够清除TS 处理BPY 中鼠伤寒沙门氏菌所产生的自由基，在此浓度范围随其浓度的增加，清除更多的自由基。自由基被清除后显著提高了鼠伤寒沙门氏菌的可培养性而使VBNC 态数量降低（图7）。当丙酮酸钠浓度达到20 mmol/L 及更高时，体系中TS 处理产生的自由基几乎全部被清除，活菌数和可培养数随丙酮酸钠浓度的增加而维持平衡，然而仍有约1.99 log10（CFU/mL）的鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC 态。结果表明自由基虽是诱导鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC态的关键因素，但非唯一因素。

3 结论

1）TS 处理导致少量鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC 状态。随着TS 处理强度（例如：功率、温度的增加及时间的延长）的增加，VBNC 态发生率指数增加。

2）TS 处理中BPY 体系产生3 种自由基，包括以碳为中心的自由基、羟基自由基与氢质子自由基。自由基强度与TS 处理条件相关，低处理强度下随着TS 处理强度的增加，自由基强度增加；过高的功率、温度与过长时间的处理反而使自由基强度降低。

3）自由基与VBNC 态发生率指数之间的相关性符合Boltzmann 模型。通过加入自由基清除剂（丙酮酸钠），进一步验证了TS 处理中产生的自由基是导致鼠伤寒沙门氏菌进入VBNC 态的关键因素，此结果可为TS 杀菌技术在食品中的应用提供参考。

图6 丙酮酸钠对TS 处理（380 W、53℃、6 min）中鼠伤寒沙门氏菌总菌数、活菌数和可培养数的影响Fig.6 Effect of sodium pyruvate on S.Typhimurium populations distribution at different concentrations as exposed to TS processing at 380 W and 53 ℃for 6 min

图7 丙酮酸钠对TS 处理（380 W、53 ℃、6 min）中BPY 体系自由基强度与鼠伤寒沙门氏菌VBNC 态发生率指数之间的关系Fig.7 Effects of sodium pyruvate on intensity of free radicals and VBNC state incidence index as exposed to TS processing at 380 W and 53 ℃for 6 min