微波预处理对苹果汁褐变及品质的影响

张婷婷 蒲云峰 侯福荣 刘 懿 叶兴乾 刘东红，2*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州310058 2 浙江大学馥莉食品研究院 杭州310058）

现阶段，中国的苹果加工产业发展迅速，苹果产能、规模居世界首位，这与其资源及成本优势密不可分[1-2]。中国苹果加工主要产品为果汁饮料以及浓缩果汁[3]，其中，苹果汁的产品有苹果清汁、苹果浊汁以及苹果浓缩汁三大类[4-5]。由于果胶、蛋白质以及纤维素等含量较高，浊汁的营养价值高于清汁[6]，所以受到越来越多消费者的欢迎。

多酚氧化酶（PPO）参与引起的酶促褐变是苹果汁加工和贮藏过程中面临的主要难题之一[7]。在预防苹果汁褐变方面，研究人员采用物理[8-11]、化学[12-13]、生物[14-17]方法对鲜榨苹果汁进行处理，均产生一定效果。然而，赵光远等[4]研究发现，约85%苹果汁褐变发生在打浆过程，在氧气存在下，多酚氧化酶快速将多酚化合物催化为醌，由于其不稳定性，无色的醌类物质进一步聚合转化为黑色素[18]，因此，在苹果破碎前进行灭酶处理极为重要。

微波是一种频率范围在300 MHz 到300 GHz的电磁波，频率越低，穿透力越强，因其能显著缩短烹调时间以及节约能耗而被广泛应用于食品工业中[19]。张少颖等[20]发现微波处理苹果块能降低多酚氧化酶活性，从而提高果汁的色值。刘素贞等[21]报道用微波对香椿进行灭酶。关于微波预处理苹果整果对果汁色值等品质的影响鲜见报道。本试验中采用微波预处理苹果整果，研究微波预处理对苹果汁褐变及品质的影响，考察整果经微波预处理后苹果汁的褐变指数、PPO 活性、酚含量等变化，为果汁加工提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择成熟度相同，外观无损伤及明显病虫害，大小均匀，质量范围在200～250 g 的中等大小新鲜富士苹果，洗净待用。

交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP，USP 级）、2,6-二氯靛酚钠盐水合物（＞95.0%）、Triton X-100（生化级）、聚乙二醇6000，阿拉丁公司；福林酚试剂（生化试剂）、三水合乙酸钠（分析纯）、二水合草酸（优级纯）、邻苯二酚（化学纯）、无水碳酸钠（分析纯）、醋酸（优级纯）、浓盐酸（优级纯）、氯化铁（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；水溶性维生素E（Trolox）、2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、2, 4, 6-三（ 2-吡啶基）三嗪（TPTZ），美国Sigma 公司。

1.2 设备与仪器

JYL-D022 型多功能全自动果汁机，九阳股份有限公司；微波炉（w25800k-01AG），宁波方太厨具有限公司；PHS-550 型pH 计，陆恒生物；1510型全波长酶标仪，Thermo Fisher；超声波清洗装置（50Hz，功率240 W），深圳市吉利特超声洗净设备有限公司；TA.XT2i 质构仪，北京微讯超技仪器技术有限公司；H7650 型透射电子显微镜，日本Hitachi公司；SU-8010扫描电子显微镜，日本Hitachi 公司；UV-2550 紫外分光光度计，日本岛津公司；ColorFlex EZ 色差仪，鼎韵中国公司；HAAKE RheoSterss 6000流变仪，Thermo Fisher Scientific。

1.3 方法

1）微波灭酶处理 将新鲜苹果洗净，置于微波炉中，微波处理后迅速置4 ℃冰箱冷却30 min。加入与苹果等质量的水，切块、去核、打浆，4 层纱布挤压过滤，得苹果浊汁。

2）传统热灭酶处理 参考胡秦佳宝[22]的方法，新鲜苹果洗净、切块、去核、打浆，苹果∶水质量比1∶1，85 ℃热水浴灭酶15 min，4 层纱布过滤，得苹果浊汁。

经过大量预试验，选定微波条件800 W，140 s【该条件处理后苹果中心温度为（96.2±2.0）℃，冷却30 min 后中心温度（52.3±3.2）℃）】，与传统热灭酶组进行对比，未处理的样品作为空白组（记为CK）。

1.3.1 色泽的测定[23]采用色差仪测定30 mL 果汁的L*、a*、b*值。褐变指数BI 计算公式为：

式中：X=（a*+1.75L*）/（5.645L*+a*-3.012b*）。

1.3.2 多酚氧化酶的测定 参考曹建康[24]的方法。取5 mL 提取缓冲液（含1 mm PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）于10 mL 果汁中，摇匀，在4℃下离心10 min，取上清液100 L 加入3 mL 0.2 mol/L 邻苯二酚缓冲液，于波长420 nm 处测定吸光度的变化。以每升样品每分钟吸光度变化值增加1 为1 个活性单位。

1.3.3 总酚含量的测定[25]称取10 mL 果汁与20 mL 甲醇匀浆，定容50 mL，然后超声30 min，离心备用。在10 mL 试管中，先加0.6 mL 提取液，然后加1 mL 福林酚试剂，混匀静置5 min，加3 mL 0.1 mol/L 碳酸钠，最后用蒸馏水定容，充分混匀后避光反应2 h，于波长760 nm 处测定吸光值。

1.3.4 可溶性醌含量的测定[26]取1.3.3 节离心后的上清液于437 nm 处测其吸光度。

1.3.5 抗氧化能力的测定

1.3.5.1 FRAP 法 准确移取20 L 样液于96 孔板中，加入配好的150 L TPTZ 工作液，37 ℃震荡反应10 min，测定波长593 nm 处的吸光值。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力，结果用等价抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC，mg/L）。

1.3.5.2 ABTS 法 准确移取20 L 样液于96 孔板中，加入配好的170 L ABTS 工作液，37 ℃震荡反应10 min，测定波长734 nm 处的吸光值。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力，结果用等价抗氧化能力TEAC（Trolox Equialent Antioxidant Capacity）表示（TEAC，mg/L）。

1.3.6 抗坏血酸（VC）含量的测定 采用2，6-二氯靛酚钠法[27]。

1.3.7 可溶性固形物（TSS）含量的测定 参考曹建康[24]的方法。

1.3.8 可滴定酸（TA）含量的测定 参考曹建康[24]的方法，结果以苹果酸（Malic）计，单位g MA/L。

1.3.9 高效液相法测定果汁中酚类化合物含量样品储备液的制备：上述总酚测定粗提取液经0.22 μm 的滤膜过滤得样品储备液。

色谱条件：色谱柱：Spursil C18（250 mm×4.6 mm）；流动相：V甲酸∶V甲醇=20 ∶80；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流速：0.7 mL/L；流动相梯度洗脱条件见表1[28]。

1.3.10 黏度的测定 用流变仪测定果汁的黏度。几何测量：P60 Ti L；间隙：1.000 mm；剪切速率：0.1～500/s；温度：25 ℃。

1.3.11 微观结构观察 通过扫描电镜及透射电镜观察打浆后苹果果肉的微观结构，与空白组和传统对照组进行对比，观察细胞形态和内部结构。扫描电镜：采用溅射镀膜法对样品表面镀金，放大5 000 倍观察。透射电镜：参考李桂峰[29]的方法，放大20 000 倍观察。

1.4 数据统计分析

试验各处理均重复3 次，求其平均值和标准差，结果用x±s 表示。用SPSS 软件进行方差分析及显著性分析。

表1 梯度洗脱程序Table1 Gradient elution steps

2 结果与分析

2.1 不同灭酶处理对苹果汁褐变及品质的影响

由表2可知，在TSS、TA、pH 方面，微波与传统热灭酶组无显著差异（P＞0.05）。微波与传统组VC 含量差异不显著（P＞0.05）。在PPO 活性方面，经微波预处理的苹果汁，PPO 活性显著低于传统组（P＜0.01）。作为酶促褐变的氧化产物，果汁中醌的产生在一定程度上意味着其内部黑色素的形成，而微波处理样品可溶性醌的含量远远低于其它两组处理（P＜0.01）。在总酚含量方面，微波组总酚含量约为传统组的1.5 倍，这可能由于微波预处理可钝化PPO 酶活性，从而减少酚类底物被氧化。此外，微波处理可能破坏细胞壁，导致细胞质大量溶出，促进细胞内酚类物质的释放，从而增加果汁中酚类物质含量。B Naderi 等[30]比较微波与传统热灭酶处理对山茱萸汁的影响，发现微波组总酚含量显著高于传统组。Xu 等[31]比较微波处理与传统烹调煎炸处理对紫甘蓝的影响，发现微波处理能够保留更高的VC 及总酚含量。这可能与微波缩短烹调时间密切相关。本试验采用FRAP法和ABTS 法评价果汁的抗氧化性。由表2可知，传统组和微波组采用FRAP 法测得的果汁抗氧化能力值分别是（112.45 ± 9.12）TEAC，mg/L 和（413.96±10.54）TEAC，mg/L；采用ABTS 法测得的抗氧化能力值分别是（482.02 ± 11.43）TEAC，mg/L 和（660.61 ± 18.00）TEAC，mg/L，可见微波处理能够显著提高果汁的抗氧化能力（P＜0.05）。在微波加热过程中，色素降解、抗坏血酸氧化、酶促褐变以及非酶褐变等均影响加工过程中食物的颜色[32]。通过对图1的观察及对表2中褐变指数BI的分析可知，微波预处理能显著改善苹果汁色泽，抑制苹果汁的褐变。这与微波预处理苹果整果，减少了苹果内部酚类物质与外界空气接触，且微波引起的快速升温能迅速灭活多酚氧化酶有关。

表2 不同灭酶处理对苹果汁品质的影响Table2 Effect of different enzyme inactivation treatment on quality of apple juice

2.2 不同灭酶处理对苹果汁黏度的影响

根据Stock 理论，果汁黏度越大，越不利于果汁颗粒的聚集沉降[4]。果汁的黏度与其果胶含量密切相关，而热处理能够增加果胶溶出，提高果汁稳定性。由图2可知，微波组黏度显著高于传统组（P＜0.05）。这可能是因为微波预处理引起温度升高，从而导致果胶溶出[33]。

图1 不同灭酶处理对苹果汁色泽的影响Fig.1 Effect of different enzyme inactivation treatment on color of apple juice

图2 不同灭酶处理对苹果汁黏度的影响Fig.2 Effect of different enzyme inactivation treatment on viscosity of apple juice

2.3 不同灭酶处理对苹果汁主要酚类化合物含量的影响

苹果中主要的酚类化合物可以分为黄酮苷（类黄酮、槲皮素及槲皮素化合物）、儿茶素和表型儿茶素、花青素、二氢查耳酮（根皮素和根皮苷）、酚酸（没食子酸和绿原酸）以及原花青素六大类[31]。图3a 显示经过传统热灭酶以及微波处理的样品的峰形与空白对照组接近，峰高大小排序为微波＞传统热灭酶＞空白对照。此外，从表3可知，微波组中大多数酚类物质含量显著高于传统组及CK 组，这可能由于微波破坏细胞结构，加速液泡内酚类物质的溶出，从而极大地提高了酚类物质含量[33]。

图3 280nm（a）、360nm（b）条件下HPLC 分析图Fig.3 The graph of HPLC analysis at the condition of 280 nm（a）and 360 nm（b）

表3 不同灭酶处理对苹果汁主要酚类物质含量的影响Table3 Effect of different enzyme inactivation treatment on main single phenolic composition of apple juice

2.4 果肉细胞表面微观结构

采用扫描电镜对CK 组、传统组及微波组样品进行检测，放大倍数为5 000 倍，如图4所示。比较三者间的差别。图4中，微波预处理组与CK组相比其细胞表面产生大量的细小裂块，而传统热灭酶组表面无明显变化。由此可知，微波预处理能够破坏果肉细胞表面结构。

图4 空白对照（a）、传统热灭酶工艺（b）、微波800w，140s（c）的扫描电镜检测Fig.4 Surface appearance of control（a），traditional heat preprocessed（b）and microwave processed 800 W 140 s（c）apple flesh

2.5 果肉细胞内部微观结构

图5 空白对照（a）、传统热灭酶工艺（b）、800W,140s（c）的透射电镜检测Fig.5 Microstructure of Control（a）, traditional heat preprocessed（b）and Microwave processed 800 W 140 s（c）apple flesh

采用透射电镜，在放大倍数20 000 倍条件下对CK 组、传统组及微波组进行透射电镜检测，如图5所示。由图5a 可以看到细胞质紧贴细胞壁，细胞器结构清晰，原生质包在液泡的外围且紧贴细胞壁。由图5b 可以发现细胞虽出现质壁分离现象，但形状排列无明显变化；从图5c 可以看到明显的质壁分离现象，原生质进入液泡，细胞器完全解体。由此得出，与传统热灭酶工艺处理相比，微波预处理能够破坏细胞结构，促进细胞质内物质的溶出，这可能由于微波较高的电场强度以及高温导致细胞膜破裂，从而使细胞内容物质泄漏[19]。

3 结论

采用微波800 W，140 s 处理苹果整果，在隔绝氧气的条件下，降低或钝化苹果中多酚氧化酶酶活，抑制苹果汁褐变，保护果汁色泽[34]。微波功率800 W，处理时间140 s 的样品，褐变指数约为传统热灭酶的50%。该方法与传统热灭酶相比，果汁中的酚类物质含量更高，果汁抗氧化能力更强，这可能由于酚类化合物主要以结合态形式存在且与果蔬的细胞壁相连，而微波预处理可快速破坏细胞结构，从而促进结合态酚类化合物的释放[35]。此外，微波预处理组苹果汁黏度更高、稳定性更好。由此可见，微波处理苹果整果是一种有潜力的加工方式。然而，微波处理的非均一性是今后微波技术的缺陷，且不同微波条件预处理对苹果汁色泽等品质的影响以及不同酚类物质含量的变化机理还有待深入研究。