黄酒固定化发酵过程及香气物质形成的研究

蒋予箭 何炯灵 王晶晶

（浙江工商大学 杭州310018）

酵母代谢相关的发酵副产物（酯类、醇类、醛类等）形成了黄酒香气的主体成分，对黄酒风味、品质等有着重要影响[1-3]。传统用游离酵母在开放的环境中发酵[4]。有研究表明酵母菌用载体固定化后发酵可以重复利用[5-6]，这简化了酵母扩培过程，降低了生产成本，同时载体的保护作用可以减少有害物质对其的抑制作用[7]。游离酵母的增殖倍数明显大于固定化酵母，而香气物质作为酵母发酵的主要副产物[8-9]。酵母增殖倍数的不同必然会导致香气物质生成量的差异，影响黄酒的品质。对酵母进行固定化处理，是否会影响黄酒香气物质的生成量，值得深入研究。虽然当前固定化发酵的技术比较成熟，但是研究固定化发酵对黄酒中香气物质形成的影响鲜有报道。

目前检测黄酒中香气物质的方法主要有气相色谱法[10]、气相色谱-质谱联用法[11-12]、毛细管气相色谱法[13]、顶空固相微萃取-气-质谱联用法[14]等。气相色谱法是比较常用的检测方法，分析速度快，分离效率高，灵敏度高，应用范围广[15-16]。殷德荣[17]用气相色谱法对乙醛、乙酸乙酯、甲醇、正丙醇、异丁醇、异戊醇、乳酸乙酯、乙酸、β-苯乙醇进行定量分析。胡健等[18]用气相色谱法检测黄酒中的香气物质。本文采用气相色谱法对黄酒中的特征性香气物质进行定性、定量分析，研究发酵过程中游离酵母与5 批次固定化酵母发酵黄酒中的特征性香气物质生成量的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米：购于超市；液化酶、糖化酶、麦曲，绍兴古越龙山集团提供；酵母（Saccharomyces cerevisiae），安琪黄酒专用活性干酵母，市售。

正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯甲醛、β-苯乙醇、乙醛、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯和乙醇均为色谱级试剂。

1.2 设备与仪器

HH-6 型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；TG16-WS 台式高速离心机，湖南沪康离心机有限公司；XFB-200 型小型粉碎机，广州鸿兴机械有限公司；SPX-250B-Z 型恒温培养箱，上海精密仪器仪表有限公司；酒精计，武强县华洋仪表厂；GC-2014C 气相色谱仪（配有FID 检测器和AOC-20i 自动进样器，日本岛津有限公司；FFAP（30 m×0.20 mm×0.25 μm）型毛细管色谱柱，上海安因科学仪器有限公司。

1.3 工艺流程

1.4 试验方法

1.4.1 酵母菌的活化 称取30 g 活性干酵母加到450 mL、2%已灭过菌的葡萄糖溶液中，38 ℃活化30 min，3 000 r/min 离心10 min，弃上清液，得到底部的酵母泥。取酵母泥40 g 加入180 mL 灭菌的蒸馏水中，得到活化好的酵母菌液。

1.4.2 固定化酵母颗粒的制备 最终发酵液体积为每瓶800 mL。为了达到发酵液酵母含量为1.0×107个/mL 的试验要求，计算800 mL 发酵液中应添加的酵母菌液的体积。将其与9 倍1.5%的海藻酸钠溶液混匀，在37 ℃水浴条件下用10 mL 注射器（带9#针头）滴加到4%CaCl2溶液中[19-20]。在21℃水浴条件下固定化1 h，最后用无菌水冲洗数遍，放入0.05%CaCl2溶液中，4 ℃平衡过夜，备用。

1.4.3 发酵液的制备 糯米用粉碎机粉碎成糯米粉，过60 目筛，备用。在1 L 锥形瓶中放入250 g糯米粉和625 mL 蒸馏水，搅拌均匀后加入1 g 液化酶，在温度为70 ℃的水浴锅中液化60 min。将游离酵母及固定化酵母分别加入后置于28 ℃培养箱中主发酵5 d，然后在15 ℃后发酵15 d。

1.4.4 制备糖化液

1）糖化液（糖化剂为酶）在1 L 锥形瓶中放入250 g 糯米粉和625 mL 蒸馏水，搅拌均匀后加入1 g 液化酶，1 g 糖化酶，在温度为70 ℃的水浴锅中糖化60 min，离心取上清液，121 ℃灭菌20 min，备用。

2）糖化液（糖化剂为麦曲）在1 L 锥形瓶中放入250 g 糯米粉和625 mL 蒸馏水，搅拌均匀后先加入1 g 液化酶（70 ℃，液化60 min），后加入麦曲37.5 g（50 ℃，糖化4 h），离心取上清液，121℃灭菌20 min，备用。

1.4.5 酵母菌的计数 将活化好的酵母菌液稀释至一定的倍数，用血球计数法计算酵母菌稀释液中的酵母数。由此得到酵母菌液中的酵母数。

1.4.6 理化指标测定 酒精度测定采用蒸馏比重法[21]，总糖测定采用亚铁氰化钾滴定法[21]，总酸测定采用酸碱中和滴定法[21]。

1.4.7 气相色谱测定香气物质 用20%乙醇溶液作溶剂配制各香气物质（正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯甲醛、β-苯乙醇、乙醛、乙酸、乳酸乙酯和乙酸乙酯）的单标和混标溶液，用气相色谱分析香气物质，得到各香气物质的保留时间和回归方程。

气相色谱检测条件参考王晶晶[22]。色谱柱：DB-FFAP 30 m×0.20 mm×0.25 μm 毛细管色谱柱；进样口温度：250 ℃；分流比：25∶1；柱流量：恒流1.5 mL/min（N2）；检测器（FID）温度：280 ℃；补充气（N2）：45 mL/min。升温程序：50 ℃（2 min）→（10 ℃/min）→80 ℃→（20 ℃/min）→150 ℃→（50 ℃/min）→200 ℃（3 min）→（20 ℃/min）→230 ℃（3 min）。氢气：40 mL/min；空气：400 mL/min；进样量：1 μL.

2 结果与分析

2.1 不同糖化液、发酵类型的酵母增值数比较

使游离酵母和固定化酵母分别在糖化剂为酶、麦曲的糖化液中增殖，分别计算发酵液中和固定化颗粒中的酵母数，结果见表1。

表1 酵母增殖数（个/mL 糖化液）Table1 Yeast breeding number（cells/mL saccharification liquid）

试验结果表明，发酵5 d 后，对于固定化发酵酵母，用酶和麦曲作为糖化剂，固定化颗粒中的酵母数增值倍数分别为11 和12.3；对于游离发酵酵母，用酶和麦曲作为糖化剂，糖化液中的酵母数增值倍数分别为18.1 和22.3。从表1可以看出，固定化酵母发酵的糖化液中的酵母数远小于固定化颗粒中的酵母数，说明固定化颗粒包埋效果好，流失少。游离酵母的增殖倍数明显大于固定化酵母，而香气物质主要为酵母发酵的副产物，酵母增殖倍数不同必然导致香气物质生成量的差异。无论是固定化酵母发酵还是游离酵母发酵，糖化剂为麦曲的酵母增殖倍数大于糖化剂为酶的酵母增殖倍数。下述试验均采用麦曲为糖化剂。

2.2 游离酵母和固定化酵母发酵过程理化指标跟踪测定结果

为研究固定化酵母多次发酵性能的稳定性，每次发酵结束后都将其中的固定化酵母分离出来，用于下一批次的发酵。固定化酵母第1～5 批次发酵过程中理化指标见图1～图3。

由图1可以看出，游离酵母发酵的黄酒在第1 天酒精体积分数就达到5.1%，固定化酵母第1至5 批酒精体积分数分别为0.6%，1.6%，2.2%，2.7%，1.8%，远小于游离酵母的酒精体积分数，可能是因为酵母被固定在载体内，存在传质限制，营养物和氧气有浓度梯度，导致固定化酵母一开始不能充分接触发酵底物，生长和繁殖受到限制。发酵第2 天，固定化酵母第1 至5 批的酒精体积分数快速上升到7.2%，8.2%，8.9%，9.8%，9.3%，接近游离酵母发酵的酒精度10.0%，这说明载体内部的酵母菌经过第1 天的适应期，产酒精速率赶上游离酵母。不论是固定化酵母（第1 至5 批）还是游离酵母，在主发酵前4 d，酒精体积分数快速上升，之后缓慢升高，趋于稳定，符合酵母发酵规律。20 d 发酵结束后，游离酵母和固定化第1 至5 批的酒精体积分数分别为14.5%，13.3%，14.1%，14.5%，13.8%，14.3%，游离酵母发酵和5 批次固定化酵母发酵的酒精体积分数没有明显差异。

图2表示第1 天发酵结束后，5 批固定化酵母的总糖含量明显高于游离酵母，这个变化与酒精体积分数的变化相关联。5 d 主发酵结束时各批次的总糖含量比较接近，游离酵母和固定化第1至5 批的总糖分别为5.1，5.8，6.3，5.4，6.1，7.6 g/L，15 d 低温后发酵期间总糖含量呈少量下降，最终（总）糖含量在5.1～7.6 g/L（＜15 g/L），各批次黄酒发酵正常、彻底。

图1 游离酵母和固定化酵母发酵过程中酒精度的比较Fig.1 The comparison of alcohol degree fermented by free yeast and immobilized yeast

图2 游离酵母和固定化酵母发酵过程中总糖的比较Fig.2 The comparison of residual sugar fermented by free yeast and immobilized yeast

图3 游离酵母和固定化酵母发酵过程中总酸的比较Fig.3 The comparison of total acid fermented by free yeast and immobilized yeast

在酒精发酵过程中酸度有所上升，一部分原因是酵母菌糖代谢产生部分有机酸副产物使黄酒酸度略有上升，这个酸度大约不超过3.3 g/L（见游离发酵）；另一部分原因是黄酒发酵为开放式发酵，发酵过程中会有少量醋酸菌、乳酸菌等杂菌进入发酵液，杂菌繁殖产生乳酸、醋酸也会使黄酒酸度上升。从图3结果看黄酒的酸度符合第5 批＞第4 批＞第3 批＞第2 批＞第1 批＞游离，初步判断固定化条件下醋酸菌、乳酸菌等产酸菌的污染程度比游离发酵为甚。随着固定化发酵批次的增多黄酒酸度呈上升趋势，第5 批次发酵结束时黄酒的总酸含量达5.3 g/L。此值符合国家标准（GB/T13662-2008）规定的3.0～7.0 g/L（干黄酒），对口感和产品保质期无明显影响。

综上，固定化酵母发酵过程的总糖、酒精度、总酸变化曲线与游离发酵过程曲线差异不大，说明固定化发酵性能稳定，重复利用率高。发酵结束时总酸含量远小于国家标准上限值（7 g/L），杂菌污染可控。

2.3 游离酵母和固定化酵母发酵黄酒的典型香气物质生成量的差异比较

综合寿虹志等[23]、鲍忠定[24]、罗涛等[25]的研究和实际生产调研，确定正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇、乙醛、苯甲醛、乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯这9 种香气物质作为黄酒发酵过程中的典型香气物质进行考察，它们的生成量作为黄酒香气的定量指标。以黄酒蒸馏液为样品，测定其中的香气物质含量，结果见图4。每个样品平行进样3 次，取平均值。

图4 酵母游离与固定化发酵结束后各香气物质生成量Fig.4 The aroma substances content after fermentation by free and immobilized yeast

由图4可以看出，发酵结束时，游离发酵和固定化发酵的黄酒样品中，正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇、乙醛、苯甲醛、乙酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯这9 种香气物质的含量比例相似，香气物质量有可比性，说明固定化酵母发酵模式不会破坏黄酒的整体香味特性。

2.3.1 黄酒中高级醇形成的差异 黄酒中的高级醇主要是在前5 d 的主发酵过程中形成，后发酵时温度降到15 ℃，高级醇形成速度迅速降低，如图5所示。游离酵母发酵产物中醇类含量较高，20 d 发酵结束时正丙醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇的总高级醇含量为680.91 mg/L，固定化酵母第1 至5 批黄酒的总高级醇含量为633.63，649.79，658.17，637.63，614.68 mg/L。

黄酒中的高级醇类物质过高是引起酒类“上头”的重要原因[26-28]。试验结果表明采用固定化酵母发酵，酵母的增殖倍数低于游离酵母发酵，副产物高级醇的形成量也较低，这对控制黄酒中的高级醇含量是有利的。

2.3.2 黄酒中酯类物质形成的差异 固定化酵母发酵产物中酯类物质的积累远超游离发酵（见图6），且黄酒中酯类总量随固定化酵母的使用次数的增多而递增，即：固定化第5 批（115.90 mg/L）＞第4 批（90.81 mg/L）＞第1～3 批（80.10～81.81 mg/L）＞游离酵母（55.66 mg/L）。结合图4可看出酯类中的乙酸乙酯的生成量为固定化第5 批（64.79 mg/L）＞第2 批（47.93 mg/L）＞第1 批（45.66 mg/L）＞第4 批（44.57 mg/L）＞第3 批（42.33 mg/L）＞游离酵母（41.53 mg/L）；乳酸乙酯的生成量为固定化第5批（51.11 mg/L）＞第4 批（46.24 mg/L）＞第1～3 批（32.17～39.41 mg/L）＞游离酵母（14.13 mg/L）。20 d发酵结束时，固定化发酵黄酒的乙酸乙酯平均值49.06 mg/L 比游离发酵提高了18%，乳酸乙酯平均值41.02 mg/L 比游离发酵提高了190%。

图5 不同发酵类型醇类总量的变化趋势Fig.5 The variation tendency of total alcohols content during fermentation by different types

图6 不同发酵类型酯类总量的变化趋势Fig.6 The variation tendency of total esters content during fermentation by different types

如果把醇类、羧酸、酯类都看作酵母的直接代谢产物，那么游离发酵过程酵母的增殖倍数大，得到的酯类物质也应该是游离发酵黄酒中更多。然而，试验结果却相反，这表明由醇类和羧酸通过酯化反应获得的酯类物质具有二次代谢产物的属性，它们在固定化的颗粒内具有一定的积累-释放效应。黄酒的酯类物质愈多，黄酒的香气愈加浓郁[29-31]。

2.3.3 固定化发酵对黄酒香气强度的影响 香气强度可以用香气活力a（OAV）来表示，它是香气物质浓度与香气物质阈值之比值，以此描述各香气物质对黄酒香气的贡献程度。嗅觉阈值是指嗅觉器官感觉到气味时，嗅感物质的最低浓度[32]。黄酒中的香气物质在嗅感强度上有着很大的差异，有些组分虽在黄酒中的浓度高，但其阈值大时，它对总的香气的贡献不会很大。本文的嗅觉阈值主要参考文献[33]，见表2。

各香气物质香气强度的和计算公式：

由表2可以看出固定酵母发酵的香气物质最终K 值依次为13.19，13.81，13.43，12.87，13.60，这些值（除第4 外）略高于游离发酵的K 值13.10，由此得出固定化发酵酿得的黄酒的香气不会比游离酵母酿得的黄酒差，有商业化应用的前景。

表2 发酵20 d 各香气物质的含量（mg/L）及根据嗅觉阈值计算的总香气强度K 值Table2 The content of the aroma substances（mg/L）and the total aroma intensity calculated by the olfactory threshold value K value after 20 d fermentation

3 结论

在实验室条件下，分别用游离酵母和5 批次固定化酵母发酵黄酒。经主发酵5 d（28 ℃），后发酵15 d（15 ℃），游离酵母和5 批次固定化酵母发酵的黄酒酒精体积分数分别为14.5%，13.3%，14.1%，14.5%，13.8%，14.3%vol，且固定化酵母发酵过程的总糖、酒精度、总酸变化曲线与游离发酵过程曲线差异不大，表明固定化酵母发酵性能稳定，重复利用率高。

用气相色谱法检测固定化发酵和游离发酵的黄酒中的9 种特征性香气物质（包括醇类、酯类、醛类），发现20 d 发酵结束时游离发酵、固定化酵母第1 至5 批黄酒的总高级醇含量分别为680.91，633.63，649.79，658.17，637.63，614.68 mg/L，说明固定化发酵有利于控制黄酒中的高级醇含量；固定化酵母发酵黄酒中的酯类总量排序为：固定化第5 批（115.90 mg/L）＞第4 批（90.81 mg/L）＞第1～3 批（80.10 ～81.81 mg/L）＞游离酵母（55.66 mg/L），说明固定化发酵使得黄酒的香气愈加浓郁。从香气总强度K 值看，固定化发酵的黄酒香气K 值普遍略大于游离酵母获得的K 值，增加香气强度。

综上，酵母固定化发酵可以简化酒母扩增环节，改善黄酒的香气物质，具有深化研究和应用的价值。