丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白乳化性质的影响

孙领鸽 毛晓英 王丹丹 吴庆智 朱新荣 万银松

（石河子大学食品学院 新疆石河子832003）

核桃在我国栽培历史悠久，种植面积广泛。核桃蛋白含有18 种氨基酸且8 种人体必需氨基酸含量均衡，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量较高[1]，生物利用率高，符合人类营养需求，是一种优质的植物蛋白源。近年来，核桃蛋白的营养价值和经济价值受到越来越多的关注，核桃蛋白的功能性质成为国内外学者的研究热点之一。杜蕾蕾等[2]研究发现在pH5 时，核桃蛋白的溶解度、持水性、起泡性和乳化性最低；毛晓英[3]研究发现适度酶解可以提高核桃蛋白质的氮溶解指数、乳化性和起泡性等功能性质。

作为食品蛋白质重要的功能性质之一，乳化性质被广泛应用在蛋糕、奶油、香肠等食品加工领域。蛋白质具有两亲性质，通过降低油-水界面的张力并吸附到界面上形成类似凝胶的玻璃化膜，从而降低乳化体系的不稳定性[4]。蛋白质的乳化性质与其结构和理化性质有关[5]。Tang 等[6]研究发现大豆蛋白在95 ℃下加热30 min，α-螺旋增加，同时蛋白溶解度和乳化性增加；Nakai[7]认为蛋白质的乳化能力与蛋白质的溶解度和表面疏水性相关。在影响蛋白质乳化性质的众多因素中，蛋白质氧化为其中之一。氧化引起蛋白质结构和理化性质的改变，并进一步导致其包括乳化性在内的功能性质发生一定程度的变化[8]。蛋白质分子受活性氧（ROS）直接攻击，或与次生氧化产物间接反应都会造成蛋白质氧化[9]。目前已发现食品中的脂肪发生氧化会对蛋白质产生影响，脂质自由基、脂质氢过氧化物和活性醛类等脂质氧化产物均能诱导蛋白质发生氧化修饰。目前对于脂质自由基和脂质活性产物诱导的蛋白质氧化影响核桃蛋白的功能性质尤其是乳化性质的研究鲜有报道。丙二醛的含量可以衡量脂质氧化的程度[10]。作为脂质过氧化次生产物中含量最多的活性醛[11]，它与蛋白质反应生成西佛碱，导致蛋白质交联。刘晶等[12]发现适度的丙二醛氧化能够增加大豆蛋白的持水性、持油性、乳化性和起泡性。

本试验以丙二醛代表脂肪氧合酶（LOX）诱导脂质过氧化反应中产生活性醛，用不同浓度（0～10 mmol/L）的丙二醛氧化核桃蛋白，以羰基值表征核桃蛋白的氧化程度，研究丙二醛氧化对核桃蛋白的表面疏水性、乳状液内源荧光、乳状液粒径分布、乳状液Zeta 电位、乳化性（EAI）和乳化稳定性（ESI）、乳析率等乳化性质的影响，为进一步研究脂质氧化诱导的蛋白质氧化对核桃蛋白功能性质的影响奠定理论基础，并为提高核桃蛋白产品在加工、贮藏过程中的品质稳定性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆薄皮核桃，新疆石河子市农贸市场；1，1，3，3-四乙氧基丙烷，美国Reanta 公司；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

F-7000 荧光光谱仪，日本日立公司；紫外-可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；PHS-3C雷磁pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；LGJ-18S 冷冻干燥机，北京松源华兴科技有限公司；SHZ-B 水浴恒温振荡器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；高速冷冻离心机，费默飞世尔科技（中国）有限公司；ELE 高速均质剪切机，上海易勒机电设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃分离蛋白的制备 根据毛晓英[3]的方法制备核桃分离蛋白。剥壳后的核桃仁用2%NaOH 浸泡4 min，去皮。分别采用正己烷（1∶5，质量比）和95%乙醇（1 ∶10，质量比）进行脱脂和醇洗。醇洗后的蛋白粉用去离子水以1∶26 的料液比（质量比）溶解得到蛋白质溶液。用1% NaOH 调节蛋白质溶液pH 值为11，搅拌1.5 h 后离心得到上清液。用1%HCl 调节上清液pH 值为4.5，搅拌1 h 后离心得到沉淀。最后调节蛋白质沉淀pH 值至中性，用冷冻干燥机冻干得到核桃分离蛋白。

1.3.2 丙二醛氧化核桃蛋白的制备 丙二醛的制备方法参照Adams 等[11]的方法并略作修改。取1 100 mg 1，1，3，3-四乙氧基丙烷溶解于50 mL 0.1 mol/L HCl 中，于50 ℃水浴锅中反应60 min后，用1 mol/L NaOH 调节pH 值至中性，在波长267 nm 处比色测定丙二醛的浓度。将核桃分离蛋白溶解于pH8.0 的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液中，加入一定量NaN3。将制备好的丙二醛与核桃蛋白溶液混合，使丙二醛在核桃蛋白溶液中的浓度分别为0，0.01，0.1，1 mmol/L 和10 mmol/L。将制备好的氧化核桃蛋白溶液在25 ℃恒温水浴振荡器中震荡避光反应24 h，透析72 h 除去未反应的丙二醛，每6 h 更换1 次去离子水。最后冷冻干燥得到丙二醛氧化的核桃蛋白。

1.3.3 乳状液的制备 将核桃蛋白样品配制成一定浓度的核桃蛋白溶液，加入体积分数10%的大豆油，用均质机均质1 次即得所需乳状液。

1.3.4 核桃分离蛋白羰基值的测定 采用2，4-二硝基苯肼法[10]测定核桃蛋白样品的羰基值，在波长367 nm 处比色，用22 000 M-1cm-1消光系数计算每毫克蛋白质羰基衍生物的物质的量。

1.3.5 表面疏水性的测定 采用8-苯氨基-1-萘磺酸盐（ANS）作为荧光探针[13]，激发波长和发射波长分别为365 nm 和484 nm。以蛋白质浓度为X轴，以荧光强度为Y 轴，得到的曲线截距即蛋白质的表面疏水性。

1.3.6 乳状液粒径的分布 乳液样品按质量比1∶100 用去离子水稀释，采用Microtrac S3500 激光粒度分布仪测定乳液的粒子大小及分布。

1.3.7 乳状液内源荧光的测定 根据Ye 等[14]的方法，采用荧光分光光度计测定氧化核桃蛋白乳液的荧光光谱。取 120 μL 乳液样品溶于6 mL 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）中，充分震荡，激发波长为290 nm，扫描发散光谱为300～400 nm，激发和发射狭缝宽均为5 nm。

1.3.8 乳状液Zeta 电位的测定 均质后的蛋白乳液用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）稀释200 倍，采用NanoPlus 电位粒径分布仪测定乳状Zeta 电位。

1.3.9 乳化性（EAI）和乳化稳定性（ESI）的测定根据Pearce 等[15]的方法，略作修改。取9 mL 1%蛋白溶液，加入3 mL 大豆油，用均质剪切机1 000 r/min 均质2 min，分别在均质0 min 和10 min 时取100 μL 乳状液溶于10 mL 0.1% SDS 中，混匀，在波长500 nm 处进行比色。以0.1%SDS 溶液作为空白。样品蛋白质浓度用双缩脲法测定。

式中：A0——均质后0 min 测定的吸光度；A10——均质后10 min 时的吸光度；N——稀释倍数，100；c——蛋白溶液的质量浓度，g/mL；φ——油占总乳液的体积分数，0.25。

1.3.10 乳析率的测定 在核桃蛋白乳液中加入一定量的NaN3防范微生物的滋生。准确吸取10 mL 乳液样品于具塞刻度试管中，室温加盖密封静置17d，记录乳析层的高度（H乳析层）。

1.4 数据处理与统计分析

试验结果用平均数±标准误差SD 表示，样本重复数n=3。采用SPSS statisics 23.0 的Dukeny检验进行显著性分析，采用Origin 8.5 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白氧化程度的影响

氨基酸侧链和肽键的氧化断裂会产生羰基[16]，羰基的形成是蛋白质发生氧化的重要表征之一，羰基含量越高表示蛋白质的氧化程度越高。图1为丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白羰基含量的影响。丙二醛浓度在0～10 mmol/L 范围，核桃分离蛋白的羰基值从3.13 nmol/mg 增至20.61 nmol/mg（P＜0.05），呈现显著性增加，表明丙二醛使核桃分离蛋白发生显著氧化。宋永娜[17]在研究丙二醛氧化修饰对虾类原肌球蛋白过敏性质的影响时发现，过敏原经100 mmol/L 丙二醛氧化处理24 h 后羰基值含量是对照组的14 倍。吴伟等[18]研究发现较高浓度的丙二醛使大米蛋白发生显著氧化。丙二醛是一种双羰基化合物，当其中一个羰基与蛋白质分子（主要是与伯胺发生加成反应）反应生成蛋白质-蛋白质复合物时引入另一个羰基[11]。另外，蛋白质分子中的半胱氨酸、组氨酸和赖氨酸残基与丙二醛发生迈克尔加成反应生成羰基-氨基复合物，从而导致蛋白质羰基值增加[19]。

2.2 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白表面疏水性的影响

蛋白质的表面疏水性在蛋白质功能性质方面发挥极其重要的作用，它与蛋白质的空间结构、蛋白质所呈现的表面性质和脂肪结合能力等有重要的关系。ANS 探针法是检测蛋白质表面疏水性最常用的方法，ANS 结合于膜或蛋白质的疏水内腔时产生强烈的荧光[20]。丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白表面疏水性的影响如图2所示。低浓度（0～0.1 mmol/L）丙二醛氧化处理使核桃分离蛋白的表面疏水性从453 增至476；当丙二醛浓度超过0.1 mmol/L 时，蛋白样品的表面疏水性从476 降至422（P＜0.05），这与叶林[21]的研究结果一致。氧化使得蛋白质分子构象发生解折叠，一些蛋白质分子内部的脂肪族和芳香族等疏水性氨基酸侧链基团暴露到极性溶液中，从而导致蛋白质疏水性增加；而随着氧化程度的增加，被暴露出来的疏水基团通过疏水相互作用结合形成不可溶性聚集体，导致疏水值下降；另外，高浓度丙二醛氧化形成的蛋白质共价交联也使得核桃分离蛋白的表面疏水性下降[22]。

图1 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白羰基含量的影响Fig1.Effect of malondialdehyde oxidation on the carbonyl content of walnut protein

图2 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白表面疏水性的影响Fig.2 Influence of malondialdehyde oxidation on hydrophobic surface of walnut protein isolates

2.3 丙二醛氧化对核桃分离蛋白内源荧光的影响

蛋白质的内禀荧光主要来源于色氨酸，色氨酸残基对微环境的变化很敏感，内源荧光光谱法是将色氨酸作为内禀荧光探针来研究蛋白质分子的构象变化[20]。丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白乳状液内源荧光的影响如图3所示。乳状液λmax处荧光强度随着丙二醛浓度的增加呈现减弱的趋势，10 mmol/L 丙二醛氧化处理的核桃分离蛋白乳状液λmax 处的内源荧光强度降到未氧化蛋白的73.83%，且λmax 从329 nm 蓝 移 至327 nm。Traverso 等[23]发现丙二醛氧化使得牛血清蛋白的内源荧光强度下降；Sun 等[24]认为蛋白质氧化的程度及蛋白结构的展开使荧光强度发生变化。核桃分离蛋白乳状液荧光强度下降和λmax 蓝移是由丙二醛氧化修饰导致的蛋白质分子交联和蛋白质聚集体包埋色氨酸而引起的。Estevez 等[25]认为氧化导致蛋白质-脂质相互作用的改变，从而减弱色氨酸的荧光强度。

2.4 丙二醛氧化对核桃分离蛋白乳状液粒径分布的影响

乳状液的粒径分布是指乳状液中油滴粒径大小，能够直观展示油滴在乳状液中的分散状态[26]，从而反映蛋白质帮助油相分散到水相中的分散能力。一般来说，液滴粒径越小乳化体系稳定性越好。图4所示未氧化和氧化核桃分离蛋白乳状液的粒径分布。在低浓度范围（0～0.1 mmol/L ）内，随着丙二醛浓度的增加，核桃分离蛋白乳状液的峰值向小粒径方向移动；当丙二醛浓度大于0.1 mmol/L 时，样品乳状液的峰值随着丙二醛浓度的增加向较大粒径方向移动。结合上述表面疏水性和乳液内源荧光的分析结果，低浓度丙二醛氧化导致核桃分离蛋白表面活性特性和蛋白分子结构的改变，使得乳液粒径减小；而不溶性聚合体的产生使更少的蛋白迁移到油水界面上乳化同样量的油脂，从而形成的液滴粒径变大；同时，小液滴通过相互碰撞形成更大的液滴，导致乳液粒径分布增大，乳化体系稳定性下降[21]。

图4 核桃分离蛋白样品乳状液粒径分布Fig.4 Droplet size distribution of walnut protein isolates emulsions

2.5 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白Zeta 电位的影响

Zeta 电位反映液滴表面的电荷量[27]，是用来表征蛋白乳液稳定性的重要指标[28]。通常乳液电位的绝对值越大，越有利于防止油滴的聚集，蛋白乳液的乳化稳定性越好。图5为核桃分离蛋白样品乳液的电位图。因样品乳液的pH 值（pH=7）高于蛋白的等电点，故所有乳液的Zeta 电位均呈现负值。由图5可知，随着丙二醛浓度的增加，核桃分离蛋白样品乳液的Zeta 电位绝对值先增加后减小；当丙二醛浓度为0.1 mmol/L 时，乳液Zeta 电位的绝对值最大，为22.38 mV。所有乳液的电位值均小于-30 mV，说明乳液较不稳定[29]。较低程度的氧化使得蛋白质结构部分去折叠，原本包埋在分子内部的疏水性氨基酸暴露出来，使得蛋白表面带电氨基酸增加，液滴分子间的静电排斥力增加，而低浓度丙二醛氧化处理的核桃分离蛋白Zeta电位绝对值增加。Stadtman[30]认为氧化导致氨基酸残基的丧失，也是液滴表面负电荷增加的原因之一。随着氧化程度的增加，蛋白质表面的带电氨基酸随着分子结构的改变而发生内卷[4]，乳液电位绝对值也随之减小。

2.6 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白乳化性和乳化稳定性的影响

蛋白质的乳化活性是指蛋白质帮助形成乳化体系的能力[22]。乳化稳定性是指在一定条件下蛋白质使乳状液保持乳化状态稳定的能力[31]。丙二醛氧化修饰核桃分离蛋白乳化性和乳化稳定的变化如图6所示。未氧化的核桃分离蛋白乳化性为45.96 m2/g，核桃分离蛋白的乳化性随着氧化程度的增加显著下降（P＜0.05），10 mmol/L 丙二醛氧化处理的蛋白乳化性降至25.86 m2/g。这是因为丙二醛氧化所致蛋白质交联和不溶性聚集体的形成，降低了蛋白质对脂肪的吸附能力。吴伟等[18]研究发现丙二醛氧化使大米乳化活性下降。乳化稳定性呈现先增加后降低的趋势，当丙二醛浓度为0.1 mmol/L 时核桃分离蛋白的乳化稳定性达到最高，为27.90 min。低浓度丙二醛氧化导致蛋白质分子结构变化，乳液粒径减小，Zeta 电位值增加，乳滴间静电斥力增大，吸附膜上的空间位阻增大，蛋白质乳化稳定性增加。随着丙二醛浓度的增加，不溶性聚集体形成，表面疏水性下降，吸附膜面积减小，蛋白质分子柔韧性降低，导致蛋白质乳化稳定性下降。

2.7 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白乳析率的影响

乳状液的稳定性是指在一定条件下，乳状液抵抗分层、絮凝、聚沉或聚结等现象的能力，通常用乳析率来评价乳液的物理稳定性[32]。蛋白质乳状液的乳析率与其粒径分布有着较强的正相关关系，也就是说，粒径越小，脂肪上浮速度越慢，乳析率越小，乳状液的状态越稳定。室温下静置17 d后不同氧化程度的核桃分离蛋白乳析率的变化如表1所示。随着丙二醛浓度的增加，蛋白乳析率呈现先减小后增加的趋势；在丙二醛浓度为0.1 mmol/L 时，蛋白乳析率最小为66.24%，说明此氧化浓度下蛋白质乳液的稳定性最好，这一结果与上述粒径分布的结果一致。而随着蛋白质氧化程度增加，乳液粒径增大，液滴间发生聚集，蛋白质乳液失稳，从而造成乳液油、水两相分层加速，乳析率增大。叶林[21]也发现低程度的氧化可以提高蛋白质乳液的稳定性。

图5 核桃分离蛋白乳液的Zeta 电位Fig.5 Zeta potential of walnut protein isolates emulsions

图6 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白乳化性和乳化稳定性的影响Fig.6 Effect of malondialdehyde oxidative on emulsification and emulsion stability of walnut’s protein isolates

表1 丙二醛氧化修饰对核桃分离蛋白乳析率的影响Table1 Effects of malondialdehyde oxidation on the creaming rate of walnut’s protein isolates

3 结论

为研究核桃分离蛋白在加工和贮藏过程中，多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应产生的活性脂类氧化产物对核桃分离蛋白乳化性质的影响，本文以实验室制备的核桃分离蛋白为研究对象，采用不同浓度（0～10 mmol/L）的丙二醛代表脂质次生产物活性醛氧化处理核桃分离蛋白。研究结果表明，随着丙二醛浓度的增加，核桃分离蛋白的羰基含量显著（P＜0.05）增加，说明丙二醛使核桃分离蛋白发生氧化；乳液内源荧光强显著下降且最大吸收波长λmax蓝移；表面疏水性呈现先上升后下降的趋势；乳液粒径和乳析率均呈现先减小后增大的趋势；乳液Zeta 电位值和乳化稳定性则呈先增加后减小的趋势；乳化活性发生显著下降。丙二醛氧化导致核桃分离蛋白分子构象和表面活性特性的改变，低浓度的丙二醛氧化虽可适当改善核桃分离蛋白的乳化稳定性，但会使蛋白质乳化活性降低；高浓度的氧化则对核桃分离蛋白的乳化性质产生负面影响。本研究为在加工过程中如何提高核桃蛋白及其产品的乳化性提供理论依据，并进一步丰富脂质氧化所诱导的蛋白质氧化对其功能性质的影响的相关理论。