不同品种苹果非浓缩还原汁的多酚组成及与抗氧化能力的关系

王彦淇 郭玉蓉 王永涛 赵 靓 吴晓蒙* 廖小军

（1 中国农业大学食品科学与营养工程学院 国家果蔬加工工程技术研究中心农业部果蔬加工重点实验室 食品非热加工北京市重点实验室 北京100083 2 陕西师范大学食品工程与营养科学学院 西安710119）

苹果是全球消费量最高的水果之一[1]，而我国拥有世界上最大的苹果及苹果汁生产量和出口量。目前市场上果汁饮料多是浓缩还原（From Concentrate，FC）果汁，它是在浓缩果汁中还原天然果汁中等量的水后得到的制品[2]，其营养价值低，产品附加值不高。近年来苹果汁产业中兴起的非浓缩还原（Not From Concentrate，NFC）果汁，是由新鲜原果压榨后直接杀菌罐装而成，其未经浓缩及复原工序，具有口感真实且营养成分（特别是抗氧化物质酚类等）保留充分等特点。尼尔森《2018年中国消费市场的十大特点和趋势》显示，消费者对于产品的功能性有了更高的追求。中国银河证券研究部资料显示，我国NFC 果汁的市场规模将呈现爆发式增长，预计2020年NFC 果汁销售额将达120 亿元。《2015-2022年中国果汁饮料行业全景调研及投资战略咨询报告》显示，美国NFC 果汁消费量占100%果汁消费结构的60%，已成为市场主流饮品且每年保持着较快的增长。NFC 果汁作为新兴健康果汁，迎合了当今消费者“健康、天然、美味”的消费追求，迅速占据了果汁市场。

苹果多酚的抗氧化和自由基清除能力很高[3-4]，具有促进致癌物代谢，影响癌细胞凋亡的作用[1]，这是其能抑制心血管疾病和前列腺癌、肝癌等癌症[5]的主要原因。前人[7-9]研究表明苹果的抗氧化能力更多地来源于多酚组分而非维生素C[6]，抗氧化能力与总酚含量之间存在极大相关性。而苹果多酚中仅有少数酚类，如黄酮类化合物[10]的抗氧化能力受到关注，黄酮类化合物在苹果中含量较低且对总抗氧化能力的贡献率未知，而其它化合物如原花青素显示出更强的抗氧化活性[11-13]。这表明苹果的抗氧化能力不仅与总酚含量有关，还与单体酚组成密切相关。具体酚类或单体酚对总抗氧化能力的作用还需进一步研究。

本文旨在通过超高效液相色谱法和两种体外抗氧化试验（DPPH 和ABTS 自由基清除试验）评价15 种NFC 苹果汁的单体酚组成和抗氧化能力。通过相关性分析综合分析多酚含量及单体酚组成的抗氧化性，旨在对苹果汁企业原料果品种的选择提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

15 种苹果（“新红星”、“玉华早富”、“元帅”、“凉香”、“新世界”、“秦艳”、“红玉”、“乔纳金”、“秋香”、“恩派”、“桔苹”、“自由”、“富士”、“粉红女士”和“秦冠”），采自西北农林科技大学白水实验站（中国，陕西），所有品种均于各自商业采收期采摘。

多酚标准品（没食子酸、原儿茶酸、表没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B2、绿原酸、4-羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、表儿茶素没食子酸酯、芦丁、金丝桃苷、鞣花酸、槲皮苷和根皮苷），Sigma-Aldrich（中国）有限公司；1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、二铵盐（2，2'-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid Ammonium Salt，ABTS）、抗坏血酸（食品级），西安晶博生物科技有限公司；甲醇、乙腈、三氟乙酸（色谱级），西安永屹生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Ultimate 3000 超高效液相色谱系统，美国Thermo Electron 公司；syncronis C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美国Thermo Electron 公司；UV1800 紫外-可见分光光度计，上海尤尼克有限公司；HU-780 榨汁机，韩国Huron 公司。

1.3 方法

1.3.1 NFC 苹果汁的制备 工艺流程：苹果→清洗、去皮去核→护色（0.6%抗坏血酸溶液，30 s）→榨汁、过滤→热杀菌（98 ℃，30 s）→均质（300 bar）→二次热杀菌（98 ℃，50 s）→灌装→冷却→储存（4 ℃）。

1.3.2 多酚成分的测定 采用UPLC 法[14]。色谱柱：ThermoRsyncronis C18 色谱柱；柱温：30 ℃。两相溶剂系统：溶剂A：30%乙腈和70%甲醇；溶剂B：1‰三氟乙酸和5%甲醇；洗脱梯度见表1，共41 min。进样量：4.0 μL；检测波长：280 nm。

表1 流动相洗脱程序Table1 Gradient elution program

1.3.3 抗氧化能力的测定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除率测定[11]将100 μL苹果汁滤液（以蒸馏水为参比）与0.9 mL 1.5×10-4mol/L DPPH 溶液混合，于18 ℃暗处反应30 min，517 nm 处测定混合物的吸光度。计算公式如下：

式中：A对照——对照组的吸光度；A样品——苹果汁滤液的吸光度。

1.3.3.2 ABTS 自由基清除率测定[11]将7 mmol/L ABTS 溶液与2.45 mmol/L 过硫酸钾溶液混合后，于23 ℃暗处反应16 h 得到ABTS 自由基正离子（ABTS·+）。混合物随即用80%乙醇溶液稀释，于734 nm 处测定其吸光度为0.700 ± 0.005。将0.1 mL 待测苹果汁（以蒸馏水为参比）样品加入3.9 mL ABTS·+溶液中剧烈震荡，室温下暗处反应6 min 后于734 nm 处测定其吸光度。计算公式如下：

式中：A对照——对照组的吸光度；A样品——苹果汁滤液的吸光度。

1.4 统计分析

本文中所有试验平行测定3 组，结果为平均值±标准差。使用origin 8.0 软件和R 语言3.2.5软件制图，SPSS 13.0 软件处理数据。单因素方差分析（ANOVA）采用Duncan 法，选取95%置信区间。

2 结果与分析

2.1 15 种NFC 苹果汁中单体酚的定性和定量分析

使用UPLC 对苹果汁的单体酚进行分析。图1为16 种单体酚标品的混合标样液相图。选取几种NFC 苹果汁多酚的典型图谱于图2中显示。

结果表明，不同种类的苹果汁中单体酚组分相似，含量差异显著。不同单体酚标品中，没食子酸极性最强，最先出峰；根皮苷极性最弱，最后出峰[15]。标准品中的16 种单体酚中仅槲皮素在15 种苹果汁中均未检出。具体每种果汁的单体酚组成见表2。按出峰顺序将16 种单体酚在15 种NFC 果汁中的含量表示成热图，见图3。

图1 16 种单体酚标准品的UPLC 色谱图Fig.1 UPLC chromatogram of the 16 individual phenolic standards

图2 秋香（a）、自由（b）、富士（c）、元帅（d）NFC 苹果汁的UPLC 色谱图Fig.2 UPLC chromatogram of the NFC apple juices from Qiuxiang（a），Ziyou（b），Fuji（c）and Delicious（d）

UPLC 结果表明，除个别单体酚在某些品种中未检出外，大部分品种均含有15 种单体酚。为排除不同生长地区、气候、生长周期、成熟度、加工方式等因素对不同苹果中单体酚含量差异的影响[16]，本研究采用同一产地、成熟度一致的苹果样品，相同加工方法制汁，控制品种差异为单一变量。

被测果汁中，含量最高的单体酚是绿原酸，这与前人[17-18]研究结果一致，其次分别是原花青素B2、表儿茶素和表没食子儿茶素，它们在15 种果汁中均有检出，含量最低的是表儿茶素没食子酸酯和咖啡酸。

图4显示15 种NFC 苹果汁中总酚指数（Total Phenols Index，TPI）和三大类多酚的含量。总酚指数是指用UPLC 方法测定的所有单体酚含量的总和[5]。在15 种苹果中总酚指数差异明显，其中，“秋香”的总酚指数最高（400 μg/mL），“自由”和“秦冠”次之，“恩派”最低（173.8 μg/mL），这与Tsao 等[19]对10 种白肉苹果中多酚含量的研究结果相似。

本研究中，15 种NFC 苹果汁中多酚主要有3类：原花青素、酚酸和黄酮类。Fabio 等[8]在“元帅”苹果果肉中检出原花青素等主要多酚的结果也佐证了本试验结果的可靠性。苹果汁中主要的原花青素类物质包括表没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯，主要的酚酸类物质为没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、4-羟基苯甲酸、咖啡酸和鞣花酸，黄酮类物质主要有芦丁、金丝桃苷、槲皮苷和根皮苷。原花青素和酚酸作为苹果汁中两类最主要的多酚类物质[20]，在本研究中分别占总酚含量的32.4%和64.0%，它们对苹果汁的抗氧化性起着重要作用。鲜食苹果中最丰富的多酚类物质是原花青素类[21]，而在本研究中，被测15 种苹果汁中的酚酸含量（102～331 μg/mL）显著高于原花青素含量（24.4～183.6 μg/mL）（P＜0.05）。这是因为原花青素水溶性低于酚酸类且光、热不稳定[20]，热杀菌对其造成较大损耗；其次，酚酸类物质水溶性好[22]，在含水量高的果汁体系中溶解度高，且酚酸中绿原酸是苹果中最主要的单体酚[19，23]。以上因素导致苹果汁中含量最高的是酚酸大类物质。由图4可以看出，苹果汁中黄酮类物质含量最低，这是因为苹果中黄酮类物质主要分布在苹果果皮中，果皮中的含量约为果肉中的2～3 倍[24]。黄酮类物质中槲皮苷的含量最高，为1.4～21.2 μg/mL，这与前人[23]研究结果（0.4～27 μg/mL）相近。

2.2 15 种NFC 苹果汁的抗氧化性

不同的抗氧化能力评价方法的反应机制和特性不同，其结论往往不同[25]。一种方法不能全面体现果汁系统中复杂的生化反应，需使用至少两种方法进行体外抗氧化能力的测定。本研究采用DPPH 法和ABTS 法对15 种苹果的抗氧化能力进行测定，15 种NFC 果汁的抗氧化能力见表3。

2.2.1 DPPH 的自由基清除能力 DPPH 是一种氮族自由基，易与具有氢原子供体的物质（本文中为苹果中的抗氧化成分）发生电子转移[26]。DPPH通过与抗氧化剂反应，自身被还原成联氨，溶液颜色由紫色变为浅黄色，结果可由分光光度计定量[27]。DPPH 自由基清除试验具有自由基稳定、灵敏度高、重现性好和受环境影响小的优点，在体外测定果蔬汁及其提取物的抗氧化能力方面具有良好的性能[28]。此外，由于DPPH 在测定浅色样品时具有较高的准确度，因此很适合测定本试验中的苹果汁样品[26]。

DPPH 试验结果显示，15 种苹果汁对DPPH自由基均有不同的清除效果，其中 “乔纳金”的DPPH 自由基清除能力最高（89.1%），“新世界”的清除能力最低（78.3%）。“新红星”、“玉华早富”、“元帅”、“秦艳”、“红玉”、“乔纳金”、“自由”和“富士”对自由基的清除率都大于85%，属于DPPH 自由基清除能力较强的品种。

2.2.2 ABTS 的自由基清除能力 ABTS 自由基阳离子清除能力试验是利用比色法来定量样品中的抗氧化活性物质对ABTS 自由基阳离子的清除能力[26]。ABTS 自由基阳离子易溶于水，很适合对果汁体系进行抗氧化能力测定。此外，果汁体系中多酚种类多且反应复杂，ABTS 试验方法可避免待测样品中过氧化物对自由基的影响，适用于复杂混合物体系中不同抗氧化物质的抗氧化能力测定[28]。

本研究中ABTS 清除能力数据略高于DPPH值，不同品种NFC 苹果汁的ABTS 自由基清除率为80.3%～92.6%，其中，“秋香”的ABTS 自由基清除能力最高，达92.6%，其次还有“富士”和“桔苹”。

对ABTS 和DPPH 测定结果显示，DPPH 自由基清除试验中“乔纳金”表现最好，而ABTS 自由基清除试验中“秋香”的清除能力最强。综合两种抗氧化能力进行分析，“富士”、“元帅”、“玉华早富”3 个品种在两个试验中都表现为较高的自由基清除率（＞85%），“新世界”、“粉红女士”、“秦冠”和“凉香”品种的抗氧化能力都较低。这一结果再次说明用多种试验方法进行抗氧化能力测定的必要性。通过多种试验对比，可以得到较为全面、可信的试验结果。

2.3 15 种NFC 苹果汁中单体酚与抗氧化能力的相关性分析

对不同品种的NFC 苹果汁中酚类组成与抗氧化能力（DPPH 和ABTS 自由基清除能力）进行相关性分析，确定对总抗氧化能力起主要作用的单体酚，结果如图5所示。相关系数（R2）取值范围在-1～1 之间，相关系数绝对值越高，该指标对抗氧化能力的贡献就越大。图5中的双标图的横、纵坐标分别代表各酚类成分与DPPH 和ABTS 的相关系数，其中内圆和外圆代表的相关系数（R2）分别为0.4 和0.6。本研究中以相关系数系数绝对值在0.4～0.6 范围时，表示该酚类成分与自由基清除能力中等程度相关；相关系数绝对值0.6～0.8 范围时，表示该酚类成分与自由基清除能力相关性强；相关系数绝对值在0.8～1.0 范围时，表示该酚类成分与自由基清除能力相关性极强。

2.3.1 单体酚与DPPH 自由基清除能力的相关性

图5 酚类组成与DPPH 和ABTS 值的相关系数双标图Fig.5 Biplots visualising the correlation between polyphenolic constituents and DPPH and ABTS values

苹果汁的三大类多酚中，原花青素含量和DPPH 值正相关性强（R2=0.64），说明原花青素大类对DPPH 自由基清除能力贡献率最大，同时，其含量高达总酚的32.4%，居于苹果汁中的第2 位。原花青素的高相关性和高含量决定了其对抗氧化能力的重要作用。原花青素大类中，有3 种单体酚（原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯）与DPPH 值呈强正相关，它们对DPPH 自由基清除能力贡献较大。在前人[30-31]的研究中也找到类似的结论。表儿茶素的相关性显著大于儿茶素（P＜0.05），说明表儿茶素具有更高的DPPH 自由基清除能力，这是由于碳环上碳3 位的顺式羟基集团比反式结构更能增强混合物的还原能力[19]。酚酸大类与DPPH 值呈强负相关（R2=-0.6）。通过分析酚酸大类组成发现，这是因为酚酸中的单体酚绿原酸与DPPH 自由基清除能力呈强负相关（R2=-0.63），且其含量最高，超过苹果汁中总酚的一半。然而，这不意味着绿原酸的存在会降低果汁的抗氧化能力，只是其含量上的增加会降低抗氧化能力与总酚含量的比值。总酚指数与DPPH 值呈负相关，这是因为酚酸大类物质占苹果汁比重很高且呈负相关。与前人[32]对“嘎啦”苹果果肉的总黄酮测定结果相似。本试验的苹果汁中黄酮含量较少，且与抗氧化能力间无显著相关性，其中的单体酚物质根皮苷与DPPH 值几乎没有相关性，说明根皮苷含量对DPPH 自由基清除能力影响可以忽略。前人[19]研究显示：根皮苷的抗氧化能力很低。也有研究显示其抗氧化能力很高[33]。本试验未使用高纯度根皮苷分析，NFC 苹果汁中根皮苷含量很低。虽然进行了相关性分析，但结果并不能代表根皮苷与抗氧化能力之间的关系。

总结3 类多酚的抗氧化能力，其抗氧化能力排序是原花青素＞黄酮＞酚酸，其中呈强正相关的单体酚有原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯，而绿原酸与DPPH 自由基清除能力呈强负相关。

2.3.2 单体酚与ABTS 自由基清除能力的相关性

由图5可知，ABTS 自由基清除能力与单体酚相关系数较低，与总酚指数相关性较大，这说明该抗氧化能力主要与总酚含量有关，受单体酚种类影响较小。

生物系统包含多种抗氧化系统，它们可能参与复杂的相互作用，其中包括食物介质中的协同或拮抗反应等[34]。目前还没有一种通用的方法能够准确反映复杂体系中的所有抗氧化活性[25]，因此很难用某一个抗氧化试验来说明某物质的抗氧化性能。不同抗氧化活性试验方法具有不同的反应机理，这也是本试验中两种抗氧化试验获得结果不完全一致的原因。虽然ABTS 值与DPPH值不完全相同，但是通过比较不同多酚与ABTS的相关性，仍能发现相同的趋势：三大类多酚中，原花青素是最主要的一类抗氧化物质。在原花青素大类中，对ABTS 自由基阳离子清除能力有主要贡献的是原花青素B2、表儿茶素和儿茶素单体酚物质。此结果与DPPH 结果相同，这进一步确认了苹果中最重要的抗氧化物质。另外，本试验中4-羟基苯甲酸与ABTS 自由基清除能力相关系数也较高。

3 结论

15 种NFC 苹果汁中多酚组分分析和抗氧化试验结果显示，NFC 苹果汁中主要的多酚大类为酚酸和原花青素，主要的单体酚物质为绿原酸、原花青素B2 和表儿茶素，总酚指数含量最高的苹果品种为“秋香”和“自由”。抗氧化能力分析评定结果：DPPH 自由基清除能力最高的品种是 “乔纳金”，对ABTS 自由基清除能力最高的品种是“秋香”。单体酚和抗氧化能力的相关性分析表明，NFC 苹果汁抗氧化能力的主要来源是原花青素大类，其中，DPPH 自由基清除能力主要与原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯3 种单体酚相关，而ABTS 自由基清除能力主要与总酚有关，与多酚组成关系不大。