解淀粉芽孢杆菌发酵豆腐工艺条件优化及营养功能研究

吴 珊 闫巧娟 骆 珅 刘 宏 杨绍青 江正强 刘 军

(中国农业大学工学院1,北京 100083)(中国农业大学食品科学与营养工程学院2，北京 100083)

心脑血管疾病是一组高发病率、高致死率、高致残率的慢性疾病。据世界卫生组织统计，2015年由心脑血管疾病引起的死亡人数占全球总死亡人数的31%，心脑血管疾病严重危害人类健康与生命[1]。在我国心脑血管疾病发病率极高且死于心脑血管疾病的人数比例不断上升[2]。血栓的形成是造成心脑血管疾病病发的重要环节，可导致中风、心肌梗塞等疾病[1]。心脑血管疾病的常用溶栓药物大多存在引起出血并发症、价格昂贵等问题[3]。

芽孢杆菌属是重要的产纤溶酶微生物，其中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌作为GRAS安全菌株被广泛应用于中国豆豉、韩国豆酱、印尼Kinema及日本纳豆等发酵食品的生产[4-6]。研究表明，由纳豆菌(Bacillusnatto)发酵制得纳豆营养丰富，具有抗血栓、抗氧化、降血压等功能，被认为是日本人长寿的“秘密”[7]。近年，采用纳豆发酵工艺开发新型食品的研究日益增多。Wei等[8]采用解淀粉芽孢杆菌发酵鹰嘴豆，在最优发酵条件下产纤溶酶活性达39.2 FU/g，且发酵鹰嘴豆的抗凝血活性和抗氧化作用较未发酵前均有提升。Feng等[9]采用枯草芽孢杆菌发酵木豆，纤溶酶活性达53.0 FU/g。

豆腐是大豆蛋白胶凝的产物[10]，其蛋白质丰富，口感细嫩，是获取优质蛋白的良好来源。由于豆腐中饱和脂肪酸含量低等优点，其在西方国家也逐渐受到欢迎[11]。然而，豆腐因其高水分和高营养性，易腐败变质，货架期较短[10]。为了改善豆腐的风味、应用及商业价值，豆腐可制成炸豆腐、冻豆腐和发酵豆腐等加工食品[12]。发酵可提高食物的保存性，还能增强原料的抗氧化、抗肥胖、抗菌等生物活性。目前，国内外消费人群较大的发酵豆腐产品有中国腐乳、臭豆腐，日本Tofuyo和马来西亚Tau ju等。发酵豆腐生产过程中需要较高盐分(4%～14%)以抑制有害微生物生长，且发酵周期较长，一般为3～6个月[13]。近年来，采用乳酸菌、蘑菇真菌、泡菜菌等微生物发酵豆腐，获得新型低盐、高营养发酵豆腐日益受到关注[14-16]。

本研究利用实验室自行筛选得到的高产纤溶酶活性解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐，通过单因素实验优化发酵条件，对具有纤溶酶活性发酵豆腐的营养成分、抗血栓活性及DPPH自由基清除活性进行分析，探讨了发酵豆腐功能活性与营养成分变化的相关性，为开发具有血栓性心脑血管疾病防治作用的发酵豆腐食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

豆腐：市售。

凝血酶(Sigma-T4648, 1KU)、纤维蛋白原(Sigma-F8630, 65%～85% protein)、Gly-Leu(Sigma-G2002)；胰蛋白胨、酵母提取物；肝素钠、福林酚试剂；其他试剂无特殊说明均为分析纯。

解淀粉芽孢杆菌 CAUNDJ118保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，16050)。

1.2 仪器与设备

TU-1810型紫外可见分光光度计；TYAIB 立式压力蒸汽灭菌锅；HZQ-F160 全温振荡培养箱；SW-CJ-1FD 洁净工作台；L-8800型氨基酸自动分析仪；GC-2010气相色谱仪；Thermo ScientificTMMultiskan FC酶标仪。

1.3 方法

1.3.1 发酵豆腐制备

称取豆腐2 000 g，切成20 mm×20 mm×20 mm方块，放入45 ℃烘箱烘至含水量为60%，置于121 ℃灭菌锅中蒸煮20 min，降温至40 ℃后接种菌液，置于37 ℃培养箱中发酵72 h。发酵过程中分别在0、6、9、12、24、30、36、48、72 h取样，样品冷冻干燥后粉碎，过40目筛备用。

1.3.2 发酵条件优化

考察初始水分(50%～75%)、菌液浓度(105～1010CFU/mL)、接菌量(2%～18%)及发酵时间(0～72 h)对发酵豆腐产纤溶酶活性的影响。

1.3.3 水解氨基酸及游离氨基酸组成的测定

参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[17]。

1.3.4 脂肪酸组成的测定

参照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》[18]。

1.3.5 还原糖、总酚含量和多肽含量的测定

准确称量1.0 g冻干样品分散于20 mL蒸馏水中，25 ℃水浴浸提2 h(200 r/min)，离心(10 000r/min，10 min)取上清液。参照福林(Folin)-酚试剂法测定上清中总酚含量[11]，以没食子酸为标准品制作标准曲线。采用邻苯二甲醛法测定上清中多肽含量[19]，以Gly-Leu二肽为标准品制作标准曲线。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定上清中还原糖含量[20]，以葡萄糖为标准品制作标准曲线。

1.3.6 纤溶酶活性的测定[9]

将冻干样品按1∶10(m/V)加入生理盐水，25 ℃水浴浸提2 h(200 r/min)，离心(10 000 r/min，10 min)取上清液。分别取1.4 mL硼砂缓冲液(50 mmol/L，pH 8.5)和0.4 mL纤维蛋白原溶液(0.72%，m/V)，混合后于37 ℃预热5 min，加入0.1 mL凝血酶溶液(20 U/mL)于37 ℃水浴中反应10 min。加入适当稀释后样品上清液0.1 mL，于37 ℃水浴中继续反应60 min，加入0.2 mol/L 三氯乙酸溶液2 mL终止反应，37 ℃静置20 min，10 000 r/min离心10 min取上清液，275 nm波长条件下测定吸光值。对照样品先加入三氯乙酸后再加入样品上清液。纤溶酶酶活定义：每分钟275 nm处吸光度增加0.01所需酶量定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力(FU)。

(1)

式中：X为样品的酶活力/FU/mL；Ar为样品吸光值；Ac为对照吸光值； 60为反应时间60 min；0.1为参加反应的样品上清液体积0.1 mL；N为稀释倍数。

1.3.7 抗凝血活性的测定[21]

采用50 mM Tris-HCl 7.2缓冲液(含0.12 mmol/L NaCl)溶解稀释牛纤维蛋白原、牛凝血酶和待测样品上清液。在96孔板中依次加入140 μL0.1%纤维蛋白原和40 μL样品上清液，于405 nm下测定吸光度值Asb(Acb)，5 min后加入10 μL 12 U/mL凝血酶，于37 ℃反应10 min，于405 nm下测定吸光度值As(Ac)。

(2)

1.3.8 DPPH自由基清除活性的测定

参照Sritongtae等[20]的方法测定发酵豆腐样品DPPH自由基清除活性。将DPPH溶解于无水乙醇中配制成0.5 mmol/L的DPPH溶液。向含有140 μL样品上清液的96孔板中加入140 μL DPPH溶液(0.5 mmol/L)，混合均匀后避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度值(A1)。以140 μL样品上清液和140 μL无水乙醇混合后的吸光度值(A2)为对照, 以140 μL无水乙醇和140 μL DPPH溶液混合后的吸光度值(A3)为空白。以水溶性维生素E(Trolox)为标准品制作标准曲线，DPPH自由基清除活性采用μmol trolox/g dw表示。

1.4 统计分析

所有实验均重复3次，结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS20.0软件进行Duncan’s multiple range test分析，P<0.05表示各组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐条件优化

发酵条件对菌株CAUNDJ118发酵豆腐产纤溶酶活性的影响如图1所示。随着初始水分的升高，发酵豆腐的纤溶酶活性随之升高。当初始水分为60%时，纤溶酶活性达到最大值51.5 FU/g；菌液浓度对发酵豆腐产纤溶酶活性的影响与初始水分相似，当初始水分为60%，接种量为6%，发酵时间24 h的条件下，CAUNDJ118菌液浓度 107CFU/mL制得发酵豆腐的纤溶活性达到最大值63.1 FU/g；当在初始水分为60%，发酵时间24 h，CAUNDJ118菌液浓度为 107CFU/mL，接种量为10%，制得发酵豆腐的纤溶酶活性最高为70.5 FU/g；随着发酵时间的延长，发酵豆腐纤溶酶活性升高，当发酵时间为36 h，纤溶酶活性最高达到86.1 FU/g。

图1 发酵时间、接种量、菌液浓度和初始水分对解淀粉芽孢杆菌发酵豆腐产纤溶酶活性的影响

目前，商业化纳豆食品中纤溶酶活性一般在20～40 FU/g[22]，经发酵条件优化后，采用解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐的纤溶酶活性达86.1 FU/g，显著高于商业化纳豆中纤溶酶活性水平。且解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐周期为36 h，与常见豆腐发酵食品相比发酵周期显著缩短。此外，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐采用无盐发酵，可避免食盐对酶的抑制作用，同时还可充分发挥低盐或无盐大豆发酵食品在膳食营养中作用[23]。

2.2 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵对豆腐氨基酸组成的影响

未发酵豆腐和解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐的总氨基酸组成如表1所示，未发酵和发酵豆腐中谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、亮氨酸含量相对较高。与未发酵豆腐相比，经48 h发酵后豆腐中谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量显著增加；而天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸以及总氨基酸含量均显著降低。解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118在发酵豆腐过程中可利用和代谢氨基酸。Yang等[24]采用灵芝菌对豆乳进行发酵后，总氨基酸含量亦显著降低[29]。

表1 未发酵豆腐与发酵豆腐的总氨基酸组成/mg/g

注：同列肩标小写字母不同表示差异显著，P<0.05；*为成年人必需氨基酸；&为抗氧化氨基酸，余同。

对豆腐发酵前后游离氨基酸组成分析发现，经解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵48 h后豆腐中游离氨基酸总含量为115.87 mg/g，显著高于未发酵豆腐。发酵后豆腐的必需氨基酸含量显著提高。CAUNDJ118发酵显著影响豆腐中的抗氧化氨基酸的含量，抗氧化氨基酸中组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸的含量均显著增加。发酵豆腐中缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和脯氨酸含量达到10 mg/g以上，分别占总游离氨基酸含量的9%、14%、10%、13%、13%和12%，游离氨基酸含量增加可能由于发酵过程中产生的蛋白酶或肽酶水解蛋白质或多肽降解成氨基酸[20]。

表2 未发酵豆腐与发酵豆腐的游离氨基酸组成/mg/g

注： LOQ为定量限。

2.3 解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵对豆腐脂肪酸组成的影响

采用气相色谱法从未发酵和发酵48 h的豆腐中鉴定出19种脂肪酸，饱和脂肪酸以C16∶0和C18∶0为主；不饱和脂肪酸则以C18∶2n6c、C18∶1n9c和C18∶3n3为主；不饱和脂肪酸占总脂肪酸组成的80%以上，其中C18∶2n6c为主要脂肪酸组成。采用乳酸菌发酵豆腐时，未发酵和发酵豆腐中主要脂肪酸为C16∶0、18∶2n6c、C18∶1n9c和C18∶3n3[25]。表3可见，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵可显著增加饱和脂肪酸含量及不饱和脂肪酸含量，但发酵前后豆腐中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值(UFA/SFA)无显著差异。UFA/SFA比值在0.6以上的食品有助于促进人类心血管健康[31]。在本研究中， CAUNDJ118发酵豆腐的UFA/SFA比值为4.85，符合联合国粮食及农业组织FAO建议值[26]。因此，CAUNDJ118发酵豆腐是不饱和脂肪酸的良好食物来源，具有预防或改善心脑血管疾病的潜力。

表3 未发酵豆腐与发酵豆腐的脂肪酸组成/mg/g

2.4 豆腐发酵过程中总酚、多肽和还原糖含量的变化

酚类化合物因其潜在的健康功效引起广泛关注。研究发现，采用枯草芽孢杆菌、kimchi和乳酸菌混合菌、Lentinusedodes或平菇菌等微生物菌株发酵豆腐，发酵后豆腐中总酚含量较发酵前增长1.1～2.5倍[15,16,27]。如表4所示，随着发酵时间的延长，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐中总酚含量不断上升，发酵48 h后总酚含量达到最高值，为13.1 mg GAE/g，增加了6.6倍。前期实验中发现，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118能够产生β-葡萄糖苷酶(未发表)。酚类化合物通常与糖相连以苷的形式存在，生物利用度较低。在发酵过程中，复杂的酚类物质可以被微生物分泌的β-葡萄糖苷酶作用，降解成为易吸收，高生物活性的可溶性酚类化合物[28,29]。多肽除具有蛋白质营养价值外，还有抗氧化、抗菌、降血压、降糖等多种生理活性[30]，并且多肽相较于其他大分子活性组分，更易被肠道吸收[31]。解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐中多肽含量随发酵时间的延长不断增加，发酵48 h后多肽含量达到最高值，增加了32.8倍。发酵开始前12 h内，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐中还原糖含量无显著变化，发酵36 h后发酵豆腐中还原糖含量达到最高值。CAUNDJ118发酵使得豆腐的还原糖含量增加了3.6倍，这可能是由于发酵过程中微生物所分泌的纤维素酶或淀粉酶的作用，将豆腐中的纤维素、淀粉等降解为低分子的还原糖[32]。

表4 CAUNDJ118发酵豆腐过程中总酚、多肽和还原糖含量的变化

注：dw为干质量。

2.5 豆腐发酵过程中DPPH自由基清除活性的变化

研究表明，豆腐的DPPH自由基清除活性较低，而经芽孢杆菌或真菌发酵可以显著提高豆腐的抗氧化作用[15,16,27]。由图2所示，随着发酵时间延长，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐的DPPH自由清除活性显著增强，在发酵48 h达到最高值。与未发酵豆腐相比，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵48 h豆腐的DPPH自由基清除活性增加4.6倍。采用韩国kimchi和乳酸菌混合发酵豆腐，7 d后豆腐的DPPH自由基清除活性增加1.1倍[15]。采用2种蘑菇真菌Lentinusedodes和Pleurotusostreatusmycelia发酵豆腐，7 d后豆腐的DPPH自由基清除活性增加2～4 倍[16]。采用枯草芽孢杆菌发酵冻干豆腐，48 h后豆腐的DPPH自由基清除活性增加2.3倍[27]。经相关性分析发现，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐的总酚含量和多肽含量与其DPPH自由清除活性呈正相关，相关系数R分别为0.98和0.99。

图2 CAUNDJ118发酵豆腐过程中DPPH自由基清除活性和抗凝血活性的变化

2.6 豆腐发酵过程中抗凝血活性的变化

研究表明，豆腐发酵食品(中国豆腐乳、日本Tofuyo和泰国Taufuyee等)具有降血压、抗氧化和抑菌等生理活性[30]。由图2所示，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐的抗凝血活性随着发酵时间延长而显著增强，且在发酵36 h达到最高值(97.9%，IC50=0.17 mg/mL)，优于阳性对照肝素钠(IC50=0.55 mg/mL)继续延长发酵时间对发酵豆腐的抗凝血活性无显著影响。经解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵后豆腐具有较强的抗凝血活性，可见发酵过程中有抗凝血物质生成。相关性分析发现，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐纤溶酶活性与其抗凝血活性之间的相关系数R=0.98，呈显著正相关。芽孢杆菌发酵黄豆可产生一种纤溶酶-纳豆激酶，具有抗凝血活性[22]。解淀粉芽孢杆菌发酵鹰嘴豆的纤溶酶活性和抗凝血活性随发酵时间的增加而增强，纤溶酶是其抗凝血活性的重要功效成分[8]。此外，研究发现乳酸菌、芽孢杆菌等细菌发酵过程中会生成抗凝血肽[33]。相关性分析发现，解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118发酵豆腐的多肽含量与其抗凝血活性的相关系数R=0.95，呈显著正相关。

3 结论

采用解淀粉芽孢杆菌CAUNDJ118对豆腐进行无盐发酵，经发酵条件优化后，发酵豆腐中游离氨基酸、脂肪酸、总酚、多肽及还原糖含量显著提高，随着发酵时间的延长，发酵豆腐的纤溶酶活性、DPPH自由基清除活性以及抗凝血活性显著增强。相关性研究发现，发酵豆腐的DPPH自由基清除活性与其总酚和多肽含量呈正相关，而发酵豆腐的抗凝血活性与其纤溶酶活性及多肽含量呈正相关。