根霉纤溶酶的酶学性质研究

李长伟，邵昕昕

牡丹江友搏药业有限责任公司

根霉纤溶酶的酶学性质研究

李长伟，邵昕昕

牡丹江友搏药业有限责任公司

目的：对根霉cw-1液体发酵生产的纤溶酶进行酶学性质初探，为天然溶栓药物的开发奠定理论基础。方法和结果：由SDS-PAGE测定该根霉纤溶酶为单一组分，相对分子量为32.5kDa；IEF电泳测定其等电点为8.3；该纤溶酶是一种糖蛋白，总含糖量为2.2%（w/v）。该纤溶酶可依次降解人血纤维蛋白的α、β和γ链。最适作用温度和pH分别为40oC和7.5；在pH5.8～10范围内，37℃保温24h，残余纤溶酶酶活在80%以上。结论：本实验研究的根霉纤溶酶可有效降解人血纤维蛋白，并且在人的正常体温下具有良好稳定性，显示了良好的溶栓药物特性。

根霉；纤溶酶；酶学性质；溶栓

血栓性疾病是严重危害人类健康的疾病之一，利用溶栓剂治疗血栓病的溶栓疗法被认为是最为有效的方法之一。微生物纤溶酶作为天然来源的溶栓药物，具有重要的临床应用前景及价值［1］。本文报道一种来源于根霉cw-1液体发酵的纤溶酶，对该纤溶酶的基本酶学性质进行研究，为进一步溶栓药物的开发奠定研究基础。

1　材料与方法

1.1仪器、材料与试剂

HASUC恒温摇床；根霉纤溶酶纯酶由根霉cw-1菌株分离纯化制得；血纤维蛋白原、尿激酶、凝血酶购自上海经科化学试剂有限公司，其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2纤溶酶活性测定

采用血纤维蛋白平板法测定纤溶酶活力［2］。

1.3根霉纤溶酶相对分子质量测定

应用SDS-PAGE法测定脉孢霉纤溶酶相对分子质量。选择凝胶浓度为12%（w/v）的分离胶，5%（w/v）的浓缩胶，交联度为2.6%，进行垂直电泳。

1.4根霉纤溶酶等电点测定

应用等电聚焦电泳（IEF）测定根霉纤溶酶的等电点。凝胶浓度T=7.5%，交联度C=3%，40%载体两性电解质，进行水平电泳。

1.5糖蛋白定性及定量实验

应用莫氏（Molish）试验对根霉纤溶酶进行糖蛋白定性实验；采用蒽酮比色法对含糖量进行定量测定。

1.6根霉纤溶酶降解人血纤维蛋白实验

将2%人血纤维蛋白（溶于pH7.5的50mMTris-HCL缓冲液）200μL与60μL 0.01mg/mL的酶液混匀置于离心管中于37oC分别保温5min、30min、1h、2h、4h和6h，以人血纤维蛋白作对照，进行SDS-PAGE检测。

1.7温度及pH对根霉纤溶酶活性的影响

取一定量纤溶酶纯酶分别置于不同温度及pH条件下（图1所示），测定相对酶活，以最高酶活为100%；分别将纤溶酶纯酶置于不同温度及pH条件下，分别放置2h、4h、12h和24h后测定残余酶活，以初始酶活为100%。

图1　根霉纤溶酶最适作用温度（a）及pH（b）

2　结果

2.1根霉纤溶酶的分子量及等电点

SDS-PAGE测定该纤溶酶的相对分子质量约为32.5kDa；IEF测定其等电点为8.3。

2.2根霉纤溶酶糖蛋白测定结果

莫氏实验结果显示该纤溶酶液面交界处有紫色环出现，说明该酶蛋白中有可能有糖存在；进一步应用蒽酮比色法确定了该蛋白含糖量为2.2%（w/v）。

2.3根霉纤溶酶降解人血纤维蛋白情况

本实验用SDS-PAGE检测该纤溶酶对人血纤维蛋白的降解规律，结果显示，作用5min后α链已经完全降解，1h后β链完全降解，2h后γ链降解完毕，这一降解顺序与人纤溶酶降解纤维蛋白各亚基的情况是一致的。

2.4根霉纤溶酶的最适温度、pH及其稳定性

实验结果显示，在pH7.5条件下，该纤溶酶的最适作用温度为40oC；在40oC下测定该酶的最适pH为7.5（图1所示）。同时，在pH5.8～10范围内，37oC保温24h，该纤溶酶残余酶活在80%以上。

3　讨论

本实验对根霉cw-1纤溶酶的纯酶进行酶学性质研究，该酶的最适作用温度及pH接近人体环境，并且在人体正常环境下测定该酶的稳定性良好。另外，该酶对人血纤维蛋白三个亚基的降解顺序与人纤溶酶一致，可见该根霉纤溶酶在性质上具有开发成溶栓药物的潜力。

［1］张雯舒，刘晓兰，郑喜群，等.蛹虫草无性型深层培养液中纤溶酶的分离纯化和酶学性质研究［J］.微生物学通报，2012（12）∶1787-1795.

［2］ASTRUP T，MULLERTZ S.The fibrin plate methed for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochem Biophys，1952（40）∶346-351.